Coloration par fluorescence de cellules de crête neurale cultivées sur des hydrogels de rigidité variable

Résumé

Source : Le, T. P., et al., Un système O9-1/hydrogel optimisé pour l’étude des signaux mécaniques dans les cellules de crête neurale. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de coloration par fluorescence à l’aide de la microscopie à fluorescence pour démontrer la coloration à la phalloidine des cellules de la crête neurale cultivées sur des hydrogels de rigidité variable afin de visualiser et d’analyser l’organisation du cytosquelette.

Protocole

1. Analyse moléculaire de la rigidité par coloration par immunofluorescence

1. À l’aide d’une pince à épiler, transportez la lamelle sur une nouvelle plaque afin de minimiser les faux signaux provenant des cellules cultivées directement sur la plaque. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS stérile trois fois pour éliminer les cellules mortes et tout milieu de culture restant.
2. Fixez les cellules à l’aide de 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez à nouveau les cellules trois fois avec 500 μL de PBS/puits pendant 2 min chacune.
   REMARQUE : Conserver à 4 °C pour un arrêt de procédure.
3. Traitez les cellules avec 500 μL de Triton X-100 à 0,1 % pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 500 μL de PBS/well.
4. Bloquez les cellules avec 250 μL de sérum d’âne à 10 % (dilué dans du PBS et 0,1 % de Tween 20) par puits pendant 30 min à température ambiante.
5. Incuber les cellules avec la phalloïdine utilisée pour la coloration de l’actine F à une dilution de 1:400 dans 250 μL de sérum d’ânesse à 10 % pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant 5 min chacune.
   REMARQUE : La phalloïdine de 568 nm peut être co-incubée avec des anticorps secondaires de 488 nm ou 647 nm ou seule.
6. Incuber les cellules avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, dilution 1:1000) dans 250 μL de PBS pendant 10 min, suivi d’un dernier lavage de PBS pendant 2 min.
7. Ajoutez 3 à 4 gouttes de milieu de montage dans chaque puits. Conservez les échantillons à 4 °C pour qu’ils durcissent pendant au moins 2 h avant l’imagerie afin de s’assurer que le support de montage a été correctement réglé.
8. Avec un microscope à fluorescence, capturez des images d’au moins 3 images aléatoires par échantillon d’hydrogel, en produisant des canaux individuels et fusionnés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2 mm #1 Corning 0211 Lamelle de protection	Chemglass Sciences de la vie	CLS-1763-012
25 mm #1 Corning 0211 Lamelle en verre	Chemglass Sciences de la vie	CLS-1763-025
Plaque de culture cellulaire à 4 puits	Thermo Scientific	179830
4 % Paraformaldéhyde	Sigma Aldrich	J61899-AP
40 % d’acrylamide	Sigma Aldrich	A4058
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher	A12379
Collagène de type I (100mg)	Corning	354236
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, chlorhydrate)	Thermo Fisher	D1306
Sérum d’âne	Sigma Aldrich	D9663
Stérile 1x PBS	Hyclone	SH30256.02
Microscope à fluorescence	Leica