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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des solutions de travail et des tampons
REMARQUE : Le matin du dosage, préparez les solutions suivantes. Ce calcul est basé sur les solutions nécessaires pour traiter deux régions du cerveau (c’est-à-dire le cortex préfrontal [PFC] et l’hippocampe [HPC]) à partir de 12 souris.
- Préparez du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF, pH = 7,4) comme mentionné dans le tableau 1. Versez 750 μL d’aCSF dans chaque tube d’échantillonnage et placez-les dans le bloc de température métallique sur de la glace pour pré-refroidir le tampon.
- Préparez le tampon de lyse comme indiqué dans le tableau 2. Conserver sur de la glace (400 μL à utiliser par échantillon).
- Préparez une solution mère de 52 mM de sous-érate de bis(sulfosuccinimidyl) ou de BS3 (26x) dans un tampon de citrate de sodium de 5 mM (pH = 5,0).
- Préparez d’abord 100 mM d’acide citrique (mère A) et 100 mM de citrate de sodium (mère B).
- Diluer les huiles A et B dans un rapport de 1:20 avec de l’eau déminéralisée. Ajouter 100 μL chacun à 1,9 mL d’eau pour préparer 5 mM d’acide citrique (matériau C) et 5 mM de citrate de sodium (matériau D), respectivement.
- Mélangez 410 μL de matière mère C et 590 μL de matière mère D pour préparer un tampon de citrate de sodium de 5 mM (pH = 5,0) (solution E, 1 mL).
- Confirmez le pH de la solution E à l’aide d’une bandelette indicatrice de pH.
- Dissoudre 24 mg de BS3 dans 806,4 μL de la solution E en tourbillonnant pendant 30 s pour préparer la solution mère de BS3 (26x).
- Préparez encore 1 mL de la solution E à utiliser comme témoin du véhicule pour les échantillons non réticulés.
REMARQUE : Préparez la solution mère BS3 lorsque tout le reste est prêt et que l’expérience est sur le point de commencer. Le BS3 doit être stocké séché à 4 °C jusqu’à utilisation. Une fois reconstitué, BS3 ne reste actif que pendant environ ≤3 h. Comme le pH du tampon de citrate de sodium de 5 mM (solution E) augmente avec le temps, provoquant une hydrolyse accélérée de BS3, il est recommandé de préparer la solution E fraîche à partir des solutions mères A et B. En raison de la solubilité limitée de BS3 à basse température, le BS3 reconstitué doit être conservé à RT. Utiliser le BS3 reconstitué dans les 3 heures, et ne pas geler/décongeler ou réutiliser le BS3 reconstitué.
2. Dissection des tissus cérébraux
REMARQUE : À partir de cette étape, au moins deux personnes doivent travailler ensemble de manière coordonnée. Pendant qu’une personne se concentre sur la dissection animale, l’autre personne doit travailler comme chronométreur et aider à coordonner le test.
- Amener le premier animal à disséquer de la zone d’hébergement à la salle de dissection.
REMARQUE : Comme les facteurs de stress aigus (p. ex., un nouvel environnement, l’odeur du sang) peuvent affecter la dynamique des protéines cérébrales, les animaux doivent être gardés dans leur cage domestique placée loin de la zone de dissection, puis être amenés individuellement dans la salle de dissection pour une décapitation immédiate.
- Euthanasier la souris par luxation cervicale suivie d’une décapitation. Retirez rapidement le cerveau du crâne et immergez-le dans du PBS glacé dans une boîte de Pétri pendant 10 à 15 s (Figure 1).
REMARQUE : Les animaux ne sont pas anesthésiés pour les expériences BS3 car tout agent anesthésique pourrait potentiellement influencer le niveau de présentation en surface des récepteurs des neurotransmetteurs.
- Placez le cerveau refroidi dans la matrice cérébrale sur de la glace, avec la face ventrale du cerveau vers le haut (Figure 2).
- Insérez la première lame de rasoir à travers la bordure entre le bulbe olfactif et le pédoncule olfactif pour couper le cerveau coronalement (Figure 3). À l’aide de trois à quatre lames de rasoir supplémentaires, coupez en série la partie antérieure du cerveau coronalement avec des intervalles de 1 mm.
- Soulevez les tranches coronales de la matrice cérébrale en tenant toutes les lames de rasoir insérées ensemble, en laissant la partie postérieure du cerveau dans la matrice cérébrale. À l’aide d’une pince, séparez les lames de rasoir les unes des autres et placez-les sur une surface plane et refroidie, la tranche de cerveau vers le haut (figure 4).
- Identifiez les tranches contenant la région d’intérêt. Pour l’échantillonnage du PFC, choisissez les deuxième et troisième tranches en arrière de la première tranche contenant le pédoncule olfactif.
- Retirez la région d’intérêt à l’aide d’un poinçon tissulaire, mettez-la de côté sur la lame de rasoir refroidie et divisez uniformément le tissu en deux (par exemple, les tissus de l’hémisphère gauche par rapport à l’hémisphère droit, une moitié devant être utilisée pour la réaction de réticulation BS3 et l’autre moitié pour le témoin sans réticulation si la protéine cible d’intérêt est exprimée de manière égale dans les deux hémisphères).
- Hachez chaque tissu en morceaux sur la lame du rasoir à l’aide de la pointe fine d’une pince avec plusieurs mouvements verticaux contre la lame au lieu d’écraser ou de broyer les tissus. Cela maximisera la surface accessible à BS3 sans compromettre gravement l’intégrité de la membrane des cellules. Immédiatement après le hachage, transférez les tissus hachés dans les tubes appropriés (voir étape 3.3).
3. Réaction de réticulation
- Amenez l’animal suivant pour la dissection de la zone d’hébergement à la salle de dissection lorsque la dissection du cerveau de la souris précédente est sur le point de se terminer (étape 2.10).
- Fixez le tube pré-refroidi sur de la glace avec 30 μL de solution BS3 (26x) ou de solution de véhicule E juste avant que les tissus hachés ne soient prêts à être transférés dans les tubes appropriés. Changez les pointes de pipette entre les tubes pour vous assurer qu’aucun BS3 n’est contaminé dans les tubes de contrôle sans réticulation.
- Transférez les tissus hachés (de l’étape 2.8) dans les tubes appropriés, puis commencez à disséquer l’animal suivant (étape 2.2).
- Retournez et mélangez le tube pour briser les morceaux de tissu en petits morceaux, et commencez à incuber les échantillons sur le rotateur de tube dans la chambre froide pendant 30 minutes à 2 heures. Enregistrez l’heure de début de l’incubation BS3 pour chaque tube. Voir la section de discussion pour le temps d’incubation optimal.
- Éteindre la réaction en dotant le tube avec 78 μL de glycine 1 M et incuber l’échantillon pendant 10 min à 4 °C avec une rotation constante. Notez l’heure de début et de fin de la trempe pour chaque tube. Continuez à aider la personne en vous concentrant sur la dissection de l’animal en amenant l’animal suivant (étape 3.1) et en aidant à la réticulation (étape 3.2).
REMARQUE : Traitez chaque échantillon exactement au même moment sur tous les échantillons. Si la salle de dissection est éloignée de la chambre froide, il est fortement recommandé de recruter une tierce personne pour participer à l’incubation et à la trempe de l’échantillon dans la chambre froide.
Tableau 1 : La composition du liquide céphalo-rachidien artificiel.
| Conc. de travail | Solution mère | Quantité de solution mère à distribuer |
| 1,2 mM de CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM de NaCl | 5 M (34x) | 1176,5 μL |
| 2,7 mM KCl | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM de MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM de glucose | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Désionisée | | 37,563 ml |
| total | | 40 ml |
| * Le bouillon de CaCl2 doit être fraîchement préparé le jour de l’expérience. |
Tableau 2 : La composition du tampon de lyse
| Conc. de travail | Solution mère | Quantité de solution mère à distribuer |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM de NaCl | 5 M (10x) | 2 mL |
| 2 mM d’EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| 1 mM de TNT | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1 % NP-40 | 10 % (100x) | 200 μL |
| Cocktail d’inhibiteurs de protéase | 100x | 200 μL |
| Désionisée | | 17 ml |
| total | | 20 mL |
