Évaluation de l’absorption du glucose dans les motoneurones des larves de drosophile avec un métabolisme du glucose régulé à la hausse

Dans cet article

Résumé

Source : Loganathan, S., et al., Mesure de l’absorption de glucose dans les modèles de drosophile de la protéinopathie TDP-43. J. Vis. Exp. (2021).

La vidéo présente une technique de mesure de l’absorption du glucose dans les motoneurones larvaires de la drosophile à l’aide d’un capteur de glucose intracellulaire basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET). Après avoir disséqué les larves pour exposer le cordon nerveux ventral, les motoneurones sont visualisés à travers la fluorescence émise par le fluorophore donneur du capteur. Lorsqu'il est stimulé par du glucose, le FRET entre les fluorophores donneur et accepteur du capteur déclenche l'émission de fluorescence de l'accepteur, ce qui permet de comparer l'absorption de glucose entre les larves témoins et les larves mutantes avec un métabolisme du glucose régulé à la hausse.

Protocole

1. Dissections du cordon nerveux ventral de la drosophile (VNC)

Fabriquer des boîtes de dissection en élastomère de silicone.
1. Versez les composants en élastomère de silicone dans un tube de 50 mL comme indiqué dans le protocole du fabricant et mélangez bien.
2. Remplissez des boîtes de culture tissulaire de 35 mm avec environ 2 ml du mélange d’élastomère. Utilisez une seringue pour enlever les bulles. Couvrez les plats et placez-les sur une surface plane dans un four à 60 °C pendant la nuit pour qu’ils durcissent.
Disséquer les larves de drosophile pour exposer le VNC tout en maintenant la viabilité des tissus.
1. Prélever une larve errante du troisième stade, la rincer avec du ddH₂O, puis la placer dans une goutte de tampon Hemolymph-like 3 (HL3) (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM de saccharose, 5 mM de tréhalose, 5 mM d’acide hydroxyéthylpipérazine éthane sulfonique [HEPES] ; pH 7,1) sur une boîte tapissée d’élastomère.
2. À l’aide d’une paire de pinces (pinces #5 ou 55) sous un microscope à dissection, épinglez les extrémités antérieure et postérieure de la larve du côté dorsal vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes (Minutein Pins).
3. Faites une incision juste au-dessus de la goupille postérieure à l’aide d’une paire de ciseaux à iris inclinés. Faites une coupe verticale en partant de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve.
4. Ajoutez quelques gouttes de tampon HL-3 si nécessaire. Enlevez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le système nerveux central (SNC). Épinglez les lambeaux qui étirent la paroi corporelle pour exposer le SNC tout en gardant le système neuromusculaire (VNC, axones et jonctions neuromusculaires) intact.

2. Acquisition d’images

Optimisez les paramètres d’imagerie.
1. Allumez le microscope et les lasers avant de commencer les dissections. Les images doivent être acquises à l’aide d’un microscope confocal droit équipé d’une lentille d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez un laser de 405 nm pour exciter la protéine fluorescente cyan (CFP) et acquérez les images dans les canaux de détection CFP (465-499 nm) et FRET (535-695 nm).
2. Optimisez les paramètres d’acquisition tels que la vitesse de balayage (6), la moyenne (2), l’objectif (40x), le zoom (1x), la taille du sténopé (1 AU) et la résolution spatiale (512 x 512). Ajustez le gain de manière à ce que le signal se trouve dans la plage dynamique optimale. Les mêmes paramètres doivent être utilisés pour tous les génotypes.
Imagez les motoneurones au sein du VNC.
1. Placez le plat en silicone avec l’échantillon disséqué sous l’objectif. Abaissez la lentille de manière à ce qu’elle entre en contact avec le tampon HL3 tréhalose-saccharose. Il est essentiel de s’assurer que l’objectif est complètement immergé dans le tampon. Ajoutez plus de tampon si nécessaire.
2. Utilisez les canaux CFP et FRET pour sélectionner manuellement une section optique composée d’au moins 6 motoneurones au foyer, situés le long de la ligne médiane VNC. Les motoneurones sont identifiés en fonction de l’expression du capteur de glucose et de leur position le long de l’axe antéro-postérieur.
3. Acquisition d’images toutes les 10 s pendant 10 min. Ces images représentent la ligne de base.
Stimuler avec du HL-3 supplémenté en glucose.
1. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirez le tampon HL3 contenant du tréhalose-saccharose et remplacez-le par 5 mM de HL-3 complété par du glucose (70 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 20 mM de MgCl₂, 10 mM de NaHCO₃, 115 mM de saccharose, 5 mM de glucose, 5 mM d’HEPES, pH 7,1). Cette étape doit être effectuée avec beaucoup de soin, afin d’éviter autant que possible le mouvement du VNC.
2. Acquérez des images toutes les 10 s pendant 10 minutes supplémentaires. Ces images représentent la phase de stimulation.
Enregistrez les images sous forme de fichiers .czi ou de tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, les conditions expérimentales (de base ou de stimulation) et les canaux utilisés.
Réutilisez les paramètres pour imager tous les génotypes (Figure 1A).

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Résultats

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Figure 1 : Analyse d’images d’un capteur de glucose dans le contexte du mutant TDP-43. (A) Images représentatives des signaux FRET et CFP dans les commandes de capteurs de glucose et les échantillons TDP-43^G298S dans des conditions de base et de stimulation. Un motoneurone représentatif est décrit dans chaque image comme un exemple de retour sur investissement. Barres d’éc...