Immunomarquage d’astrocytes marqués par fluorescence dans une coupe de tissu cérébral de souris

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Immunomarquage

REMARQUE : Effectuez tous les lavages et incubations sur un agitateur de plate-forme orbitale réglé à environ 100 tr/min. Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, à l’exception de l’incubation primaire des anticorps, qui est effectuée à 4 °C. Préparez le milieu de montage à l’avance en mélangeant les ingrédients dans un tube de 50 ml et en les mélangeant sur un nutator pendant la nuit. Protéger de la lumière et conserver à 4 °C jusqu’à 2 mois. Si le signal fluorescent endogène est suffisant pour l’imagerie et l’analyse sans qu’il soit nécessaire de procéder à une immunomarquage, les étapes 1.1 à 1.9 peuvent être sautées. Si vous sautez l’immunomarquage, effectuez trois lavages de 10 minutes dans le TBS et passez à l’étape 1.10.

1. Préparez une solution fraîche de TBST (0,2 % de Triton dans le TBS) en ajoutant 1 mL de Triton-X à 10 % dans un tube de 50 mL et en remplissant le tube à 50 mL avec 1x TBS. Préparez 2 mL de solutions de blocage et d’anticorps (10 % de sérum de chèvre dans le TBST) pour chaque cerveau.
   note: Pour de meilleurs résultats, faites du TBST frais pour chaque nouvelle expérience de coloration et utilisez une source de haute qualité de Triton-X aqueux à 10 % (Table des matériaux).
2. Étiquetez une plaque à 24 puits selon le schéma (Figure 1). Placez différents échantillons sur différentes rangées et différentes solutions dans différentes colonnes. Ajouter 1 mL de TBST aux trois premières colonnes (« Lavage 1 », « Lavage 2 » et « Lavage 3 »). Ajouter 1 mL de solution bloquante à la quatrième colonne.
3. Préparez un pic en verre en faisant fondre l’extrémité d’une pipette Pasteur 5,75 dans un petit crochet à l’aide d’un bec Bunsen. Utilisez ce pic pour transférer des sections de tissu de la plaque à 12 puits dans la colonne Wash 1 de la plaque à 24 puits.
   note: Pour de meilleurs résultats, tamisez les sections avant de commencer la coloration. Pour dépister des sections, transférez les sections une par une dans une boîte de Pétri remplie de 1x TBS et examinez les sections à l’aide d’un microscope fluorescent avec un objectif 5x ou 10x pour vous assurer qu’un nombre adéquat de cellules marquées par fluorescence sont présentes. Il est recommandé de teindre quatre à six sections par puits, mais jusqu’à huit par puits peuvent être colorées si nécessaire.
4. Lavez les sections pendant 10 minutes chacune dans les puits Wash 1, 2 et 3, puis incubez-les pendant 1 h dans la solution de blocage. Utilisez le pic à verre pour transférer les sections d’un puits à l’autre. Le médiator peut être utilisé pour transférer plusieurs sections cérébrales à la fois.
5. Préparez 1 mL de solution d’anticorps primaires pour chaque échantillon (p. ex., Rabbit RFP 1:2000 ou Chicken GFP 1:2000). Ajouter l’anticorps à la solution d’anticorps, agiter brièvement, puis centrifuger pendant 5 minutes à ≥ 4 000 x g à 4 °C. Incuber les sections de l’anticorps primaire pendant deux à trois nuits à 4 °C en agitant.
6. Après l’incubation de l’anticorps primaire, aspirez le TBST du jour 1 des puits de lavage, ajoutez 1 ml de nouveau TBST dans chaque puits de lavage et déplacez les sections dans le premier puits de lavage. Lavez les sections 3x pendant 10 min chacune.
   note: Pour l’aspiration, utilisez une pipette Pasteur de 9 pouces reliée à un tube à une fiole à vide. Des conduites de vide domestiques ou une pompe à vide électrique peuvent être utilisées comme source de vide.
7. Pendant que les sections sont lavées, préparer des solutions d’anticorps secondaires à une concentration de 1:200 en ajoutant des anticorps à la solution d’anticorps (p. ex., anti-lapin 594 ou 488 anti-poulet 488). Vortex brièvement, puis tournez pendant 5 min à ≥ 4 000 x g à 4 °C.
8. Incuber des sections dans l’anticorps secondaire pendant 3 h à température ambiante. Protégez les sections de la lumière pendant cette étape et toutes les étapes suivantes pour atténuer le blanchiment des anticorps secondaires.
9. Après l’incubation secondaire de l’anticorps, aspirez le TBST du jour 2 dans les puits de lavage, ajoutez 1 ml de nouveau TBST dans chaque puits de lavage et déplacez les sections dans le premier puits de lavage. Lavez les sections 3x dans TBST pendant 10 min chacune.
10. Lors du lavage final, retirez le support de montage à 4 °C et laissez-le se réchauffer à température ambiante. Préparez un mélange 2:1 de 1x TBS :eau distillée et ajoutez-le à une boîte de Pétri. Préparez une lame de microscope en ajoutant 800 μL de 2:1 TBS :dH₂O à la surface.
    note: L’utilisation de supports de montage non durcissables est fortement recommandée. Le durcissement des supports de montage peut modifier le volume du tissu, ce qui peut perturber l’analyse du volume du territoire astrocytaire. Une recette pour un support de montage maison simple et peu coûteux est fournie dans la table des matériaux.
11. À l’aide d’un pinceau fin, transférez les sections une à la fois du puits Wash 3 dans la boîte de Pétri. Cette étape permet d’enlever le triton et d’aider les sections à s’aplatir. Ensuite, transférez les sections de la boîte de Pétri dans le liquide sur la lame.
12. Utilisez un pinceau pour aider à disposer les sections de manière à ce qu’elles soient à plat sur la lame. Retirez délicatement l’excès de liquide de la lame à l’aide d’une pipette P1000, puis effectuez une aspiration sous vide.
    note: Ajoutez une pointe de pipette P200 à l’extrémité de la pipette Pasteur pour un contrôle plus précis de l’aspiration intra-utérine.
13. Une fois que tout l’excès de liquide est retiré de la lame, utilisez une pipette de transfert pour ajouter immédiatement une goutte de support de montage à chaque section et posez doucement une lamelle sur la lame. Laissez le support de montage s’étaler pendant quelques minutes, puis retirez tout support de montage en excès qui sort de sous la lamelle par aspiration sous vide.
    note: Ne laissez pas les sections sécher avant d’ajouter le support de montage. Si les sections commencent à sécher avant l’ajout du support de montage, cela peut avoir un impact sur le volume des tissus et entraver la collecte précise des données.
14. Scellez les quatre bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent. Laissez sécher les lames pendant 30 min à température ambiante, puis stockez-les à plat à 4 °C. Attendez au moins 2 h avant d’imager, ou d’imager le lendemain.
    REMARQUE : Les coupes colorées avec des anticorps contre la GFP (protéine fluorescente verte) et la RFP (protéine fluorescente rouge) peuvent être stockées jusqu’à 2 semaines avant l’imagerie, à condition qu’elles soient complètement scellées avec du vernis à ongles.

Figure 1 : Vue d’ensemble du flux de travail pour l’analyse du volume du territoire des astrocytes. (A) Le protocole nécessite une souris avec un marquage fluorescent clairsemé ou en mosaïque des astrocytes. (B) La souris est perfusée, puis le cerveau est réséqué, traité et congelé. (C) Le cerveau congelé est sectionné à l’aide d’un cryostat, et (D) les sections de tissu flottant librement sont collectées. (E) Après la section, les sections de tissu flottant sont colorées par immunohistochimie, puis (F) montées sur des lames. (G) Les astrocytes à l’intérieur des coupes de tissus montés sont imagés à l’aide de la microscopie confocale. (H) Enfin, les volumes de territoire des cellules imagées sont quantifiés à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images.