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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Section des tissus
- Coupez un petit morceau de tissu (~1 cm x 1 cm) pour le sectionner. Remettez le reste du mouchoir dans un congélateur à glace sèche/-80 °C.
REMARQUE : Assurez-vous que la section de tissu est composée à ~95 % de cortex cérébelleux, où se trouvent les cellules de Purkinje.
- Placez un monticule d'OCT d'environ 3 mm de haut pour couvrir le « mandrin ». Commencez par construire les couches sur le dessus dans un mouvement lent et circulaire jusqu’à ce qu’il y ait un petit monticule.
- Une fois que l’OCT est partiellement congelé mais qu’il y a encore un peu de liquide au centre, placez le mouchoir dessus. Ne poussez pas le mouchoir profondément dans l’OCT. Laissez le mouchoir reposer dessus jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé, ce qui prendra 1 à 2 minutes.
- Placez le « mandrin » avec l'OCT congelé et le tissu dans le bras de coupe du cryostat. Ajustez le tissu de manière à ce qu’il affleure la lame de coupe.
- Laissez le tissu reposer dans le bras de coupe pendant 15 à 20 minutes pour s’adapter à la nouvelle température.
NOTE : Selon l’épaisseur du tissu, il faut du temps pour l’acclimatation à la température. Laissez le mouchoir reposer aussi longtemps que nécessaire pour couper proprement. Ajustez l’OT et la CT pour aider à l’acclimatation à la température des tissus.
- Rapprochez lentement le tissu de la lame. Une fois que le tissu a atteint la lame, commencez le processus de coupe. L’épaisseur de coupe doit être fixée à 30 μm.
- Coupez 2 à 3 fois jusqu’à ce que les couches du cortex soient visibles.
- Placez et alignez la plaque anti-roulis juste au-dessus de la lame du cryostat.
REMARQUE : Une ligne argentée apparaîtra à partir de la lumière dans le cryostat à l’interface de la lame et de la plaque anti-roulis. Cela indique que la plaque anti-roulis se trouve directement sur le bord de la lame.
- Commencez à couper les sections à 14 μm. Les sections correctement coupées seront plates sous la plaque anti-roulis.
REMARQUE : Si le mouchoir est coincé, assurez-vous que la plaque anti-roulis est suffisamment froide. Si nécessaire, le fait de placer un morceau de glace carbonique à l’extérieur (du côté ne touchant pas la scène) refroidira rapidement la plaque anti-roulis.
- Découpez 4 à 6 sections et alignez-les horizontalement sur l’étage du cryostat.
- En inclinant la lame, ramassez tous les morceaux de tissu en même temps.
REMARQUE : À l’aide des pinceaux, soulevez les extrémités du tissu pour les rendre plus facilement disponibles pour la lame lors de la prise en charge. Ne prenez pas une section à la fois. L’exposition à l’air à température ambiante dégradera l’intégrité de l’ARN.
ATTENTION : Ne laissez pas la membrane toucher l’étage du cryostat. Si la membrane touche la platine, elle commencera à se détacher de la lame de verre et provoquera des erreurs lors de la tentative de LCM.
- Passez immédiatement à l’étape 6. Ne retardez pas la fixation.
2. Fixation des tissus/visualisation sans tache
- Passer immédiatement au protocole de fixation de l’éthanol
- Placez la diapositive dans le support de diapositive avec de l’éthanol à 70 % pendant 2 min - sur de la glace.
- Placez la diapositive dans le support de diapositive avec de l’éthanol à 95 % pendant 45 s - sur de la glace.
- Placez la diapositive dans le support de diapositive avec de l’éthanol à 100 % pendant 2 min — à RT.
- Trempez la diapositive 3 fois dans le support de diapositive avec du xylène 1 — à RT.
- Placez la diapositive dans le support de diapositive avec du xylène 2 pendant 5 min — à RT.
- Laisser sécher dans un endroit propre pendant au moins 30 minutes. Des temps de séchage plus longs, jusqu’à 60 minutes, sont optimaux.
ATTENTION : Utilisez des lames debout pour le séchage dans une hotte. Le xylène est volatile. La pose des lames à plat provoquera une accumulation de xylène dans la section du tissu, ce qui rendra le tissu trop foncé.
3. Décongélation des lames stockées pour utilisation
- Retirez le tube d’une seule lame du congélateur à -80 °C 1 h avant l’utilisation prévue.
- N’ouvrez pas immédiatement le tube. Laissez le tube revenir à température ambiante. La condensation se produira uniquement à l’extérieur du tube.
- Une fois que le tube a atteint la température ambiante et que toute condensation a disparu (environ 30 à 40 minutes), retirez le capuchon et exposez la lame à l’air à température ambiante.
- Laissez la lame s’acclimater à la température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, laissez-le à l’intérieur du tube avec le capuchon retiré.
REMARQUE : La diapositive est maintenant prête pour LCM.
4. Microdissection par capture laser des cellules de Purkinje :
REMARQUE : Cette section du protocole ne traitera que des spécificités liées à la capture de cellules de Purkinje pour le séquençage ultérieur de l’ARN. Cette section suppose que l’utilisateur est familiarisé avec le microscope de capture laser UV et le logiciel associé.
- Nettoyez la platine du microscope et le bras de récupération du capuchon avec le décontaminateur RNase.
- Avec les mains gantées, placez la lame sur le microscope et le capuchon opaque de 500 μL dans le bras de prélèvement.
REMARQUE : Assurez-vous toujours d’une technique d’ARN appropriée en nettoyant la zone de travail avec un décontaminateur RNase et en utilisant des mains gantées tout en touchant la lame ou le capuchon opaque. Les gants peuvent être retirés une fois que la glissière et le capuchon sont en place et que la capture laser a commencé.
- À faible grossissement, alignez le capuchon opaque sur le tissu cérébelleux, en vous assurant que le capuchon couvre toute la zone visualisée dans l’oculaire.
REMARQUE : Seul l'oculaire du microscope indiquera si le capuchon opaque est centré. La caméra ne montrera pas si le capuchon est centré sur le tissu. Selon la conception de la lunette de capture laser, la visualisation à travers le capuchon opaque se fera soit dans l’oculaire uniquement, soit visualisée à la fois dans l’oculaire et dans la caméra.
- Visualisez les couches cérébelleuses avec une lentille d’objectif 5x - 10x et placez le curseur sur la section où la couche moléculaire et la couche cellulaire granulaire se croisent (la couche cellulaire de Purkinje).
- Passez à 40X et visualisez les cellules de Purkinje.
REMARQUE : Voir Figure 1 et Figure 2 pour des visualisations par exemple.
- Commencez à capturer des cellules de Purkinje.
REMARQUE : Au moins 5 ng d’ARN sont nécessaires pour effectuer le séquençage de l’ARN. Environ 1600 à 2000 cellules de Purkinje produisent suffisamment de matériel ARN pour le séquençage. L’ARN sera stable jusqu’à 8 heures au microscope. Testez l’énergie UV et la focalisation UV avant la collecte pour vous assurer que les niveaux sont corrects. Au fil du temps, les tissus continueront à se dessécher et il peut être nécessaire de modifier l’énergie UV et la concentration des UV.
