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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Stockage des cerveaux
- Retirer rapidement la cervelle de souris sauvages CD1 adultes euthanasiées pesant environ 30 g à l’aide d’une approche conventionnelle et les congeler pendant 60 secondes dans de l’azote liquide ou de l’isopentane pré-refroidi avec de la glace sèche.
- Conservez les cerveaux congelés à -80 °C dans du papier d’aluminium ou des tubes coniques jusqu’à utilisation.
2. Préparation de la matrice cérébrale
- Vingt-quatre heures avant de disséquer les tissus, placez une matrice cérébrale propre sur une pile de blocs réfrigérants décongelés. Placez les côtés de la matrice en sandwich entre deux blocs réfrigérants, en veillant à laisser environ 0,5 cm entre le bas des fentes du rasoir et le haut des blocs réfrigérants (Figure 1A). Placez du papier d’aluminium sur les extrémités pour faciliter le refroidissement.
NOTE : Lorsque vous achetez une matrice cérébrale, achetez-en une qui est suffisamment grande pour englober tout le volume du cerveau à disséquer.
- Placez la boîte contenant la matrice cérébrale et les packs de congélation dans un congélateur à -20 °C avec le dessus entrouvert pendant la nuit.
3. Configuration d’une plaque de verre congelée
NOTE : Le but de cette configuration est de préparer une surface gelée sur laquelle disséquer des sections de cerveau.
- Placez la glace dans une boîte isolée jusqu’à environ 5 cm du haut. Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 cm sur la glace et recouvrez d’une bâche en plastique noir pour faciliter la visualisation de l’échantillon (Figure 1B, Figure 1C).
- Placez une plaque de verre (qui doit juste tenir dans l’ouverture de la boîte) sur le plastique et placez de la glace sèche sur la plaque dans les coins les plus éloignés (Figure 1C).
- Prenez la matrice cérébrale congelée du congélateur et insérez le cerveau à couper côté cortex vers le haut. Laissez-le s’équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 min. Gardez le couvercle sur la boîte pendant ce temps.
- Ajustez la position du cerveau dans la matrice à l'aide d'une pince froide de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s'alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc (Figure 1D). Cela aidera à assurer des sections symétriques pour une dissection plus facile. Touchez brièvement les pointes des pinces sur la glace sèche pour refroidir avant d’ajuster le cerveau.
- Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir refroidie près de son centre et enfoncez la lame d’environ 1 mm dans le tissu. Ajoutez des lames réfrigérées aux extrémités rostrale et caudale pour aider à maintenir le cerveau en place (Figure 2A et Figure 2B).
- En commençant par l’extrémité rostrale, ajoutez les lames une à la fois, en les plaçant dans les fentes et en les enfonçant doucement dans le tissu sur environ 1 mm (Figure 2B). Continuez à ajouter des lames à intervalles de 1 mm en travaillant vers l’extrémité caudale.
- Assurez-vous que le cerveau ne se déplace pas pendant cette période. Alignez les lames horizontalement et verticalement (Figure 2B). Des lames microtome à profil bas peuvent être utilisées pour couper des sections de 0,5 mm de largeur. Placez-les entre les plus grandes lames de rasoir (Figure 2C).
- Une fois les lames en place, appuyez sur le dessus du groupe avec les doigts, la paume ou une autre surface plane (Figure 2C, Figure 2D). Balancez lentement le groupe de lames d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers les tissus.
REMARQUE : Cela peut prendre un certain temps (1 à 2 min) et demande de la patience. Il devrait y avoir une résistance aux lames se déplaçant à travers les tissus. Une entrée facile signifie que le cerveau est en train de dégeler et que le bloc doit être refroidi avec de la glace sèche.
- Lorsque toutes les lames ont atteint le bas des fentes, saisissez chaque côté du groupe de lames et balancez-vous d’avant en arrière pour vous libérer de la matrice.
REMARQUE : Faites attention pour éviter de vous couper sur les bords tranchants des lames.
- Une fois que le groupe est libre, placez la pile, côté rostral vers le haut, sur la plaque de verre (Figure 2E). Placez de la glace sèche à côté et/ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons et faciliter la séparation.
- Placez la pile avec les bords tranchants vers le bas sur la plaque de verre et séparez les lames en déplaçant la pile entre les pouces et les doigts. Les lames doivent se séparer les unes des autres avec des sections attachées.
- Alignez les sections sur la plaque de verre du rostral au caudal (Figure 2F).
- Séparez le tissu des lames en fléchissant les lames entre les doigts ou en les séparant avec un deuxième rasoir à froid (Figures 2G, 2H, 2I).
4. Dissection de sections
- Ouvrez l’Allen Mouse Brain Atlas ou une autre référence et trouvez les points de repère nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Parmi les points de repère évidents, citons la commissure antérieure, le corps calleux, les ventricules latéraux et l’hippocampe (Figure 3).
- Retournez la section à couper à l’aide d’une pince réfrigérée et assurez-vous que la région sur le point d’être recueillie est cohérente sur toute la longueur. Pendant la récolte, consultez souvent l’atlas de référence pour vous assurer d’obtenir le bon retour sur investissement.
NOTE : Une loupe ou un microscope à dissection est souvent utile dans ce processus. Un bon éclairage est également essentiel. Des lampes LED de faible puissance ou une lampe froide peuvent être utilisées à cet effet.
- À l’aide d’un scalpel ou d’un poinçon propre, coupez la section (Figure 4). Prérefroidissez chaque outil avant de le couper en le touchant brièvement à la glace sèche. Enfoncez doucement mais fermement la lame dans le tissu, en la balançant d’avant en arrière pour faire la coupe. Ne poussez pas trop fort ou le tissu se fracturera.
NOTE : Les outils se réchaufferont avec le temps. Des lames légèrement réchauffées peuvent aider à faire des coupes nettes et à limiter la fracturation, mais veillez à éviter de dégeler les tissus. Refroidissez périodiquement les outils sur de la glace sèche.
- Une fois qu’un retour sur investissement est récolté, placez-le dans des tubes de 1,5 ml étiquetés et pré-refroidis. Conservez les tissus récoltés à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
