Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Culture et chargement du disque intervertébral (IVD)
- Transférez les disques intervertébraux (DIV) dans les chambres de DIV et ajoutez un milieu de culture DIV (milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/L de DMEM à haute teneur en glucose pour le groupe physiologique et 2 g/L de DMEM à faible teneur en glucose pour le groupe pathologique) + 1 % de pénicilline/streptomycine + 2 % de sérum de veau fœtal + 1 % d'ITS (contient 5 μg/mL d'insuline, 6 μg/mL de transferrine et 5 ng/mL d’acide sélénieux) + 50 μg/mL d’ascorbate-2-phosphate + 1 % d’acide aminé non essentiel + 50 μg/mL d’agent antimicrobien pour les cellules primaires) et placer dans un incubateur à 37 °C, 85 % d’humidité et 5 % de CO2.
- Cultivez les disques pendant 4 jours dans un système de bioréacteur selon les groupes expérimentaux. Dans le groupe pathologique, maintenir les conditions de charge dégénérative à 0,32-0,5 MPa, 5 Hz pendant 2 h/jour. Dans le groupe témoin physiologique, utilisez un protocole de charge de 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz pendant 2 h/jour.
REMARQUE : Placez les IVD dans des chambres contenant 5 mL de milieu IVD pendant les procédures de chargement. Le volume dépend de la taille des chambres de chargement du bioréacteur. Entre les procédures de chargement, placez les DIV dans des plaques à six puits avec 7 ml de milieu de culture IVD pour la récupération de l’enflure libre.
- Pour analyser les changements de hauteur du disque pendant la période expérimentale, mesurez la hauteur du disque avec un pied à coulisse après la dissection IVD (ligne de base), puis quotidiennement après la période de gonflement libre et après la charge dynamique pendant la durée de l’expérience.
2. Injection de facteur de nécrose tumorale intradiscale alpha (TNF-α)
- Directement après le premier cycle de chargement dynamique le jour 1, placez les IVD dans une boîte de Pétri en position verticale et stabilisez les IVD avec une pince à épiler.
- Injecter du TNF-α recombinant (100 ng dans 70 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par DIV) avec une aiguille à insuline de calibre 30 dans le tissu du noyau pulpeux du groupe pathologique. Injecter lentement à une vitesse d’environ 70 μL en 1 min.
- Après l’injection, tirez la seringue à mi-chemin dans l’IVD et tirez sur le piston de la seringue pour créer un vide qui empêche la solution injectée de s’écouler avant de retirer complètement l’aiguille et la seringue de l’IVD.
REMARQUE : Effectuez une expérience pilote en injectant du PBS contenant du colorant bleu trypan pour évaluer la distribution de la solution injectée après le chargement et la culture pendant la nuit.
