Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et l’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation avant le prélèvement de tissus
- Réglez la centrifugeuse sur 4 oC.
- Polir au feu un ensemble de trois pipettes Pasteur en verre avec des diamètres décroissants d’environ 1,3, 0,8 et 0,4 mm pour chaque échantillon.
- Préparez des tubes étiquetés de 1,7 ml contenant 1 ml de tampon A froid et conservez les tubes sur de la glace.
- Préparez un bac à glaçons contenant la matrice de tranchage du cerveau, des spatules et des plaques de verre (ou une boîte de Pétri en verre inversé) sur lesquelles effectuer la dissection. Pré-refroidissez deux lames de rasoir ou plus sur les plaques de verre et utilisez du papier de soie pour sécher tous les instruments qui touchent le tissu.
- Décongeler la solution enzymatique à température ambiante (RT) pendant 30 minutes avant le prélèvement des tissus.
2. Prélèvement et dissection de tissus
- Initier le traitement comportemental ou pharmacologique 90 min avant le prélèvement de tissus.
REMARQUE : Pour les résultats présentés ici, des injections intrapéritonéales aiguës de 5 mg/kg de méthamphétamine ont été effectuées sur des rats dans un nouvel environnement (condition d’essai) et des rats naïfs gardés dans leurs cages domestiques (condition de contrôle).
- Anesthésiez le rat en le plaçant dans un bocal en verre avec de l’isoflurane saturé et décapitez le rat 30 à 60 secondes plus tard à l’aide d’une guillotine.
Utilisez des ciseaux pour retirer la peau et le muscle de la tête et exposer le crâne. Utilisez des rongeurs pour couper le crâne, ouvrir le foramen magnum et retirer la partie arrière du crâne. Utilisez des rongeurs pour couper le long des bords supérieurs du crâne afin d’exposer le cerveau. Attention à ne pas endommager le cerveau. À l’aide d’une petite spatule, on enfonce doucement le cerveau et on l’élève. Soulevez le cerveau et coupez les nerfs jusqu’à ce que le cerveau soit libre.
- Disséquez les tissus à l’aide de lames de rasoir.
REMARQUE : Prélevez des échantillons de tissus en utilisant l’une des méthodes suivantes : (2.3.1) tissu fraîchement disséqué ; (2.3.2) tissus congelés après dissection ; ou (2.3.3) de tissus congelés disséqués à partir de cerveaux entiers congelés. Gardez la matrice de tranchage du cerveau, les lames de rasoir et la plaque de verre sèches tout au long des processus de dissection et de hachage, car l’eau condensée peut entraîner une lyse hypotonique des cellules. Utilisez des loupes pour assurer une dissection précise.
- Pour les tissus fraîchement disséqués, placez le cerveau fraîchement extrait dans une matrice de tranchage du cerveau (un moule métallique en forme de cerveau de rat avec des fentes pour les lames de rasoir à des intervalles de 1 mm) qui a été refroidie sur de la glace. Insérez deux lames de rasoir pré-refroidies ou plus dans les fentes pour couper des tranches coronales contenant la ou les régions cérébrales d’intérêt. Placez la tranche coupée sur la plaque de verre réfrigérée.
Remarque : Disséquez les régions cérébrales d’intérêt sur une plaque de verre réfrigérée.
- Pour les tissus congelés après dissection, disséquer la ou les régions cérébrales d’intérêt à partir de tranches de cerveau fraîchement extraites, semblables à celles décrites ci-dessus à la section 2.3.1. Placez le tissu disséqué dans un microtube et congelez rapidement le tissu en immergeant le microtube dans de l’isopentane à -40 ºC pendant 20 secondes. Conservez les tissus disséqués congelés en tout temps dans un congélateur à -80 ºC jusqu’à ce qu’ils soient traités ultérieurement.
- Pour les tissus congelés, congelez immédiatement le cerveau fraîchement extrait dans de l’isopentane à -40 ºC et conservez-le dans un sac scellé à -80 ºC jusqu’à 6 mois.
- Le jour de la dissection, placez le cerveau congelé dans un cryostat réglé à environ -20 ºC (pas plus chaud que -18 ºC) pendant environ 2 heures pour équilibrer la température.
REMARQUE : Les cerveaux peuvent être coupés facilement à cette température, tandis que des températures beaucoup plus froides rendent le cerveau trop fragile pour être coupé en toute sécurité.
- Utilisez des lames de rasoir pour couper des tranches coronales de 1 à 2 mm de cerveaux congelés dans un cryostat. Dans des conditions de congélation, utilisez une aiguille émoussée de calibre 12 à 16 pour obtenir des poinçons tissulaires à partir de ces tranches. Conservez les tissus disséqués congelés en tout temps jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
- Ajoutez 1 à 2 gouttes de tampon A pour couvrir le tissu disséqué avant de le hacher. Retirez la majeure partie de la substance blanche du tissu à l’aide de deux lames de rasoir pour éviter la perte de neurones pendant le reste du processus de trituration. Si vous commencez avec du tissu congelé, laissez le tissu décongeler sur la plaque de verre froid pendant pas plus de 1 minute avant d’appliquer la solution tampon A.
- Hachez le tissu 100 fois dans chaque direction orthogonale avec une lame de rasoir sur une plaque de verre refroidie. Tenez la lame de rasoir verticalement contre la plaque de verre lors du hachage.
NOTE : Un hachage minutieux est essentiel pour toutes les étapes du protocole.
- À l’aide de lames de rasoir, transférez le tissu haché dans des tubes de microcentrifugation contenant 1 ml de tampon A froid. Retournez le tube 3 à 5 fois pour garder tout le tissu haché dans la solution.
3. Dissociation cellulaire
REMARQUE : Utilisez un mélange doux de bout en bout pour toutes les étapes suivantes. N’utilisez pas de mélangeur vortex et évitez les bulles d’air qui endommagent les cellules.
- Centrifuger les tubes d’échantillon à 110 x g pendant 2 min à 4 ºC. Jeter le surnageant. Ajoutez lentement 1 ml de solution enzymatique froide et fraîchement décongelée (contenant un mélange d’enzymes protéolytiques) le long de la paroi interne du microtube. Aspirez immédiatement la pastille entière et pipetez doucement de haut en bas seulement 4 fois avec une pipette de diamètre de pointe modérément grand pour disperser la pastille de tissu haché.
- Retournez immédiatement les microtubes pour éviter que la pastille ne colle au fond, et incubez les échantillons en les mélangeant bout à bout pendant 30 min à 4 oC.
- Après la digestion enzymatique des tissus, centrifuger les tubes à 960 x g pendant 2 min à 4 ºC. Retirer le surnageant et ajouter 0,6 ml de tampon A froid. Immédiatement après avoir ajouté le tampon A, utiliser la même pointe de pipette pour disperser la pastille en aspirant toute la pastille et pipeter doucement de haut en bas 5 fois.
- Triturez mécaniquement le tissu digéré et collectez-le dans des tubes de 15 ml en suivant les étapes suivantes. Pour chaque échantillon, utilisez un ensemble séparé de 3 pipettes Pasteur en verre poli au feu avec des diamètres descendants d’environ 1,3, 0,8 et 0,4 mm fixées à des ampoules en latex.
- Triturez doucement chaque échantillon 10 fois avec la pipette en verre de 1,3 mm. Laissez l’échantillon reposer pendant 2 min sur de la glace (les débris et les cellules non dissociées se déposeront au fond). Prélever le surnageant (~ 0,6 ml) et le transférer dans un tube conique de 15 ml (tube #1).
- Ajouter 0,6 ml de solution tampon A à la pastille restante. Triturez l’échantillon 10 fois avec la pipette en verre de 0,8 mm. Laissez l’échantillon reposer pendant 2 min sur de la glace. Prélever le surnageant (~ 0,6 ml) et le transférer dans le même tube conique #1 de 15 ml.
- Ajouter 0,6 ml de solution tampon A à la pastille restante. Triturez l’échantillon 10 fois avec la pipette en verre de 0,4 mm. Laissez l’échantillon reposer pendant 2 min sur de la glace. Prélever le surnageant (~ 0,6 ml ; sans toucher la pastille avec les cellules non dissociées) et transférer dans le même tube conique #1 de 15 ml.
REMARQUE : Gardez la pipette de 0,4 mm de diamètre dans le tube #1 pour les étapes de trituration suivantes.
- Répétez l’étape 3.4.3 trois fois de plus à l’aide de la plus petite pipette en verre (~ 0,4 mm de diamètre) et prélevez le surnageant dans un tube conique séparé de 15 ml (tube #2).
- Triturez les suspensions cellulaires collectées dans les tubes #1 et #2 10 fois de plus à l’aide de la pipette en verre de 0,4 mm et maintenez-les sur de la glace.
4. Fixation cellulaire et perméabilisation
- Préparez 4 microtubes par échantillon (deux microtubes pour les cellules du tube #1 et deux pour les cellules du tube #2) en ajoutant 800 μl d’éthanol 100 % froid (stocké à -20 oC avant utilisation) dans chaque tube et conservez-les sur de la glace. Remarque : La concentration finale d’éthanol sera de 50 %.
- Pipeter ~ 800 μl des suspensions cellulaires (à partir du tube #1 et du tube #2) dans chacun des 4 tubes contenant de l’éthanol froid et retourner les tubes pour mélanger les échantillons.
- Incuber les tubes sur de la glace pendant 15 min tout en inversant les tubes toutes les 5 min.
- Après fixation/perméabilisation, centrifuger les tubes à 1 700 x g pendant 4 min à 4 ºC et jeter le surnageant. Laisser 50 μl de solution pour éviter la perte de cellules.
REMARQUE : Les pastilles à ce stade sont blanches et collent moins à la paroi des tubes qu’avant la perméabilisation. Par conséquent, retirez le surnageant avec précaution en touchant la paroi du microtube où il n’y a pas de pastille et aspirez lentement le surnageant à l’aide d’une micropipette.
5. Filtration cellulaire
- Remettez les granulés en suspension à partir de l’étape 4.4 avec du PBS froid comme suit :
- Ajoutez 550 μl de PBS froid dans l’un des deux microtubes provenant du tube #1, et utilisez une pointe de pipette de diamètre modérément grand pour pipeter doucement la suspension cellulaire de haut en bas 5 fois. Répétez la même chose pour un microtube provenant du tube #2.
- Pour les cellules du tube #1, à l’aide de la même pipette, transférez la première suspension cellulaire dans la deuxième pastille. Remettez en suspension la deuxième pastille en pipetant doucement la suspension cellulaire combinée de haut en bas 5 fois.
- Pour les cellules du tube #2, remettre en suspension et combiner les pastilles (i.e., troisième et quatrième microtubes) comme décrit en 5.1.2.
