L'augmentation des rendements d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de la transcriptase inverse en utilisant Microstreaming acoustique

Résumé

Nous décrivons une nouvelle méthode pour augmenter le rendement d'ADNc de cellule unique quantités d'ARNm dans les réactions de laboratoire standard de transcription inverse contraire. La nouveauté réside dans l'utilisation d'un micromélangeur, qui utilise le phénomène de la microstreaming acoustique, de mélanger les liquides à l'échelle du microlitre plus efficacement que secouer, vortex ou trituration.

Résumé

L'expression des gènes en corrélation avec le comportement des cellules est idéalement effectué au niveau unicellulaire. Cependant, ce n'est pas facile à réaliser car la petite quantité d'ARNm labiles présents dans une seule cellule (1-5% de 1-50pg ARN total, soit 0,01 2.5pg-ARNm, par cellule ¹⁾ dégrade la plupart du temps avant qu'elle puisse être une transcription inverse dans une copie d'ADNc stables. Par exemple, en utilisant des réactifs de laboratoire standard et matériel, seul un petit nombre de gènes peut être évaluée qualitativement par cellule ^2. Une façon d'augmenter l'efficacité de la norme de laboratoire de la transcriptase inverse (RT) des réactions (réactifs standard dans des volumes microlitre) comprenant une seule cellule quantités d'ARNm serait plus rapide mélanger les réactifs pour l'ARNm peut être converti en ADNc avant qu'il ne se dégrade. Toutefois, ce n'est pas anodin car à l'échelle du microlitre écoulement du liquide est laminaire, c'est à dire les méthodes actuellement disponibles de mélange (c'est à dire secouer, vortex et trituration) ne parviennent pas à produire suffisamment de mouvement chaotique efficacement mélanger les réactifs. Pour résoudre ce problème, micro-échelle des techniques de mélange doivent être utilisées ^3,4. Un certain nombre de technologies basées sur microfluidiques mélange ont été développés avec succès d'augmenter les rendements de réaction RT ^5-8. Cependant, les technologies microfluidiques nécessitent du matériel spécialisé qui est relativement cher et n'est pas encore largement disponibles. Une solution moins coûteuse, plus pratique est souhaitable. L'objectif principal de cette étude est de démontrer comment l'application d'un roman "micromélange" technique de laboratoire standard réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARNm augmente considérablement leurs rendements d'ADNc. Nous trouvons des rendements d'ADNc augmenter d'environ 10 à 100 fois, ce qui permet: (1) un plus grand nombre de gènes à analyser par cellule; (2) une analyse plus quantitative de l'expression des gènes, et (3) une meilleure détection des gènes de faible abondance dans des cellules individuelles. Le micromélange est basé sur acoustiques microstreaming ^9-12, un phénomène où les ondes sonores se propageant autour d'un petit obstacle créer un débit moyen près de l'obstacle. Nous avons développé une acoustique microstreaming basée sur l'appareil («micromélangeur") avec une simplification clés; microstreaming acoustiques peuvent être obtenus à des fréquences audio en s'assurant que le système a une interface liquide-air avec un petit rayon de courbure ^13. Le ménisque d'un volume microlitre de solution dans un tube fournit un rayon suffisamment petit de courbure. L'utilisation des fréquences audio signifie que le matériel peut être peu coûteux et polyvalents ^13, et des acides nucléiques et d'autres réactifs biochimiques ne sont pas endommagés comme ils peuvent être avec sonicateurs de laboratoire standard.

Protocole

1. Micromélange une réaction de RT

1. Avant d'effectuer une réaction de RT avec micromélange, à équilibrer le micromélangeur à la température désirée de la réaction de RT.
   1. Placez le dans un micromélangeur 37 ° C (ou la température recommandée par le fournisseur RT) incubateur pour au moins 1 heure avant le début de la réaction de RT.
2. Mettre en place le mix RT en fonction de la transcriptase inverse du fournisseur (par exemple, MMTV-RT de Promega, Omniscript de Qiagen) des instructions, sauf à usage unique cellule du total des quantités d'entrée ARN (par exemple 0.1-1pg/μl), au lieu de la g-ng quantités recommandées par les fournisseurs.
   1. Nous utilisons la norme stérile, sans nucléase 200 pl à parois minces tubes PCR.
3. Position des tubes RT solidement dans le micromélangeur dès qu'ils sont prêts pour le mixage. Le micromélangeur devrait rester à l'intérieur de l'incubateur 37 ° C pendant la durée de la réaction de RT.
4. Sélectionnez la fréquence appropriée et l'amplitude de micromélange. Dans cet exemple nous utilisons 150Hz.
5. Allumez le micromélangeur le et laissez-le pendant toute la durée de la réaction de RT (60 minutes).
6. Allumez le micromélangeur off et de prendre les tubes RT une fois la réaction de RT est terminée.
7. Placer les tubes sur la glace RT et procéder comme normal avec d'autres applications telles que Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR ou PCR en temps réel).

2. Les résultats représentatifs:

L'avantage de micromélange dans le contexte des réactions RT est une augmentation du rendement par rapport à l'ADNc lorsque d'autres méthodes de mélange (par exemple, secouer, ou vortex trituration) sont utilisés. Ceci peut être vu, par exemple, sur l'analyse ultérieure de l'ADNc en utilisant la polymérase quantitative Réaction chaîne (qPCR ou PCR en temps réel). La figure 2A illustre les effets de micromélange pour les 5 premières minutes (en bleu ", micromixed5") ou les 60 minutes toute (rouge, "micromixed60") par rapport à la trituration de la réaction de RT immédiatement avant l'incubation RT (noir », la trituration" ). Dans ce cas, le volume de la réaction précédente RT a été 25 pi et il contenait 2.5pg d'ARN total. traces qPCR utilisant des amorces conçues pour détecter les ADNc NURR-1 représente l'ARNm sont présentés ci-dessus, et les moyens ± SEM du nombre de cycles pour atteindre la fluorescence maximale de 50% en 3 répétitions de cette même expérience sont tracées ci-dessous. L'astérisque indique une différence statistiquement significative (ANOVA à un facteur avec des comparaisons multiples de Tukey). Notez que pour le micromélange les 5 premières minutes de la réaction précédente RT produit une amélioration non significative au cours de trituration alors micromélange pour les 60 minutes toute la réaction précédente RT a produit une amélioration significative par rapport trituration, dont l'ampleur était équivalente à environ 15 qPCR cycles, en moyenne.

L'avantage de micromélange peut également être vu dans la fonte analyse de la courbe des produits obtenus qPCR ultérieures. Dans l'expérience illustrée dans la figure 2B, micromélange pour les 60 minutes toute la réaction précédente RT abouti à un signal qPCR cohérent dans des échantillons en double (figure 2BA, 2 traces rouges), tandis que micromélange pour les 5 premières minutes ou la trituration ne produit qPCR incompatibles des traces (figure 2BA, 2 bleus et 2 traces traces noires, respectivement). Les traces grises sont des contrôles négatifs («neg.") Dans lequel l'ADNc a été écarté de la réaction PCR quantitative. Lorsque les produits qPCR de cette expérience ont été dénaturées par ramping leur température (ie analyse la courbe de fusion), il était évident que appropriée des produits de PCR (ie un amplicon qui était identique à celle obtenue lorsque les concentrations beaucoup plus élevées d'ARNm ont été reverse transcrit et amplifié par PCR quantitative, données non présentées) étaient présents seulement suite aux réactions RT qui avait été micromixed pendant 60 minutes (figure 2Bb, 2 traces rouges). Tous les autres (c'est à dire micromixed5, la trituration et des contrôles négatifs) générés produits alternatifs amplicon (dimères d'amorces, par exemple).

Figure 1. Schéma du protocole d'application de la norme de laboratoire micromélange réactions RT. Des descriptions plus détaillées du principe physique en cause, le micromélangeur et comment construire une micromélangeur en interne sont fournis dans les références ^13,14

Figure 2. Représentant de données qPCR illustrant les avantages de micromélange appliquée aux précédentes réactions RT comprenant une seule cellule quantités d'ARNm dans les autres standards des réactions RT laboratoire. Traces qPCR Un exemple détecter l'ARNm de l'ADNc codant pour la représenter NURR-1 du gène. Les réactions précédentes RT contenue 2.5pg d'ARN total dans un volume de 25 pi et ont été réalisées dans un incubateur à 37 ° C pendant 60 minutes. Réactions RT ont été mélangés par la trituration de la RT mélanger avant d'incubation (traces noires », la trituration»), micromixed pendant les 5 premières minutes de la réaction de RT (traces bleues, "micromixed5») ou micromixed pour les 60 minutes de toute la réaction de RT (traces rouges », micromixed60" ). Moyens ± SEM du nombre de cycles nécessaires pour atteindre qPCR fluorescence maximale de 50% sont tracées ci-dessous pour n = 3 répétitions de cette expérience. L'astérisque indique une différence significative (ANOVA à un facteur avec des comparaisons multiples de Tukey). B Une autre expérience qPCR examinant NURR-1 produit d'ADNc, cette fois suite aux réactions RT contenant 25pg d'ARN total dans un volume de 25 pi. traces qPCR (a) ainsi que la fonte analyse de la courbe des produits obtenus qPCR (b) sont indiqués pour les différentes conditions de mélange. Des contrôles négatifs dans lequel aucun ADNc a été inclus dans la réaction précédente RT sont également inclus (traces grises », neg."). Réactions RT avec des concentrations beaucoup plus élevées d'ARNm ont également été réalisées et produites pics courbe de fusion (données non présentées) identiques à ceux de (b) pour micromixed60 (traces rouges) des échantillons.

Discussion

La méthode d'application de la norme de laboratoire micromélange réactions RT décrites ici peuvent, bien sûr, impliquent l'ARNm récoltés par n'importe quelle méthode (par exemple des cellules de lyse, microdissection laser de capture). Il peut également comprendre toute les marques ou les types de réactifs RT, n'importe quelle température (dans la tolérance des matériaux de l'micromélangeur), et toute période de temps. Par exemple, nous avons observé l'amélioration des rendements d'ADNc à par...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
L'ARN total a été isolé de pression congelés préparés intensément pour adultes tranches mésencéphale de souris
PicoPure RNA Kit	Arcturus, CA, USA	KIT0204	Le kit est désormais disponible auprès de Applied Biosystems
Sans ADN traitement à la DNase et réactifs de suppression	Ambion	AM1906M
Hexamère aléatoire amorces	Promega	C1181
AMV-RT	Promega	M5101
dNTP jeu	Promega	U1240
RNasine Inhibiteur de la ribonucléase	Promega	N2111
Eau sans nucléase	Promega	P1193
SYBR Vert PCR Master Mix	Applied Biosystem	4309155
Hprt avant (20mer): CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT
Hprt inverse (20mer): TAT GTC CCC TGA CTG CGT AT
Nurr1 avant (23mer): CAG CCT CGA TTT CTT TCC CAA AG
Nurr1 inverse (23mer): GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA
NanoDrop 1000 Spectrophotomètre.	Thermo Scientific
Corbett Rotor Gene RG-6000	Corbett Life Science		Corbett Life Science a été acquise par QIAGEN en Juillet 2008