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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des membranes cérébrales de souris
- Décapiter la souris à l’aide d’un appareil à guillotine et disséquer rapidement le cerveau (en <1 min, si possible, pour minimiser les changements de palmitoylation qui peuvent se produire pendant la procédure de dissection). Homogénéiser immédiatement dans 10 mL de tampon d’homogénéisation (Tableau 1) dans un homogénéisateur en verre (~12 coups) sur glace.
- Centrifuger les lysats pendant 15 min à 1 400 x g à 4 °C. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube sur de la glace. Remettre la pastille en suspension (~6 coups) dans un volume égal de tampon d’homogénéisation et centrifuger à 710 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Combinez les surnageants de l’étape 1.2 et centrifugez à 40 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
- Jeter le surnageant (fraction cytosolique) et remettre en suspension la fraction membranaire granulée (P2) dans un tampon d’homogénéisation.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés et stockés à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
- Effectuez un dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) pour quantifier les niveaux de protéines. Pour l’essai de décalage de gel d’échange d’acyl-PEGyle (APEGS), commencer avec ~100−200 mg de protéine (maximum 250 mg) dans un volume de 470 μL de tampon A (Tableau 1) dans un tube de 1,5 mL. Sonicate et centrifuger à >13 000 x g pendant 10 min à 25 °C pour éliminer les protéines insolubles. Transférez les protéines solubilisées dans un nouveau tube de 1,5 mL.
2. Essai de décalage de gel d’échange d’acyl-PEGyle (APEGS)
- Rompez les liaisons disulfure et bloquez les cystéines libres.
- Rompre les liaisons disulfure en incubant dans 25 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP ; 25 μL, ajoutée à partir d’une solution mère ; Tableau 1) pendant 60 min à 55 °C.
- Bloquer les cystéines libres avec 50 mM de N-éthylmaléimide (NEM ; 12,5 μL, ajouté à partir d’une solution mère ; Table 1) à température ambiante pendant 3 h.
REMARQUE : La réaction peut être prolongée pendant la nuit.
- Effectuer la précipitation du chloroforme méthanol (CM).
- Transférez la solution protéique d’un tube de 1,5 mL dans un tube en polypropylène ou en verre qui peut être centrifugé dans un rotor à godets oscillant à vitesse modeste. Un tube de 5 ml est idéal. Ajouter quatre volumes (2 ml) de méthanol (MeOH) et agiter brièvement le vortex.
- Ajouter deux volumes (1 ml) de chloroforme et agiter brièvement.
- Ajouter trois volumes (1,5 mL) d’eau déminéralisée (dH2O) et agiter brièvement.
- Centrifugez les échantillons à 3 000 x g pendant 30 min à 25 °C dans un rotor à godets oscillants.
- Retirez et jetez soigneusement la phase supérieure.
- Ajouter 3 volumes (1,5 ml) de MeOH et mélanger doucement mais soigneusement, en faisant attention de ne pas fragmenter la crêpe protéinée opaque.
- Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min à 25 °C dans un rotor à godets oscillants.
- À l’aide d’une pipette sérologique en verre, prélever la partie supérieure de la phase supérieure sans déranger la galette protéinée.
- Rincez soigneusement la pastille avec 1 mL de MeOH.
- Faites sécher la pastille à l’air libre pendant au moins 10 min.
REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être conservés à -20 °C.
- Effectuer le clivage des liaisons palmitoyl-thioester avec de l’hydroxylamine (NH2OH, HAM).
- Remettre le précipité protéique en suspension dans 125 μL de tampon A et sonicer brièvement. Centrifuger à >13 000 x g pendant 10 min à 25 °C pour éliminer les matières insolubles. Transférez les protéines solubilisées dans un nouveau tube de 1,5 mL.
- Ajouter 375 μL de tampon H (HAM+ ; Table 1) ou tampon T (HAM- ; Tableau 1) et incuber des échantillons pendant 60 min à 25 °C.
- Répétez les précipitations CM décrites à l’étape 2.2.
REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être conservés à -20 °C.
- Ajoutez du mPEG aux cystéines non protégées.
- Mettre les pastilles en suspension dans 100 μL de tampon A contenant 10 mM de TCEP. Transférer dans un tube de 1,5 ml.
REMARQUE : Il est normal qu’une perte significative de protéines se soit produite pendant les étapes de précipitation du CM. Toutes les étapes suivantes seront effectuées dans un tube de 1,5 ml, limitant le volume de protéines à un maximum de ~120−130 μL. Cela réduira la perte de protéines lors de la précipitation finale de CM.
- Ajouter 20 mM de mPEG-5k (25 μL, ajouté à partir d’une solution mère ; Tableau 1) pour échantillonner les protéines et les mélanger par pipetage. Incuber pendant 60 min à 25 °C avec rotation de bout en bout.
- Pour éliminer le mPEG-5k non incorporé, effectuez la précipitation de CM comme décrit à l’étape 2.2 en utilisant les volumes ajustés suivants : 4 volumes de MeOH (500 μL), 2 volumes de chloroforme (250 μL) et 3 volumes de dH2O (375 μL). Centrifugeuse à >13 000 x g pendant 10 min à 25 °C.
- Retirez délicatement la phase supérieure comme précédemment, en évitant la crêpe épaisse et floculante. Ajouter 1 ml de MeOH et mélanger doucement mais soigneusement. Centrifugeuse à >13 000 x g pendant 10 min à 25 °C.
- Retirez délicatement le surnageant et rincez la pastille avec 1 mL de MeOH. Centrifugeuse à >13 000 x g pendant 10 min à 25 °C. Granulés secs à l’air.
REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être conservés à -20 °C.
- Remettre en suspension la pastille séchée dans 50 μL de tampon A (sans PTCE ni agent réducteur).