Fabrication de microbilles de polymère libérant de la bêta-amyloïde pour la modélisation de la maladie d'Alzheimer

Résumé

Source : Almari, B., et al. Fabrication de microbilles d'alginate sécrétant de l'amyloïde β pour une utilisation dans la modélisation de la maladie d'Alzheimer. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo fait la démonstration d’une méthode de fabrication de microbilles de polymère qui encapsulent des cellules neurotoxiques sécrétant de la bêta-amyloïde. La suspension cellule-polymère est traitée à travers un dispositif de fabrication de microbilles, la gélification du polymère étant obtenue par réticulation du calcium, formant des microbilles sphériques autour des cellules. Le polymère permet la prolifération cellulaire tout en permettant une libération contrôlée et à long terme de bêta-amyloïde, simulant son accumulation dans la maladie d'Alzheimer.

Protocole

1. Préparatifs

1. Préparez 100 mL de solution mère d’alginate à ~4 % (p/v).
   1. Peser 4,4 g de sel d’alginate sodique et ajouter la poudre sèche à 100 mL de solution saline tamponnée HEPES (HBS, 20 mM d’acide hydroxyéthylpipérazine éthane sulfonique [HEPES] (0,477 g) avec 150 mM de NaCl (0,877 g) dans de l’eau déminéralisée permettant l’hydratation.
   2. Utilisez un agitateur magnétique à ~500 tours par minute (tr/min) et chauffez jusqu’à 50 °C pour permettre une hydratation complète de l’alginate.
      note: L’alginate peut avoir besoin d’une ou deux heures pour être complètement hydraté. Pour gagner du temps, la solution d’alginate peut être préparée un jour avant le protocole d’encapsulation et stockée à 4 °C jusqu’au lendemain. Lorsque l’alginate a été réfrigéré, chauffer doucement à 37 °C à l’aide d’un bain-marie ou d’une plaque chauffante et agiter avec un agitateur magnétique immédiatement avant utilisation.
   3. Filtrer stérilement la solution d’alginate à l’aide d’un filtre en polyéthersulfone (PES) à pores de 0,22 μm avant utilisation. Il est recommandé de filtrer à 37 °C pour permettre un écoulement facile de l’alginate. La viscosité augmentera si la température est laissée baisser.
2. Préparez 1 000 ml de 0,5 M de CaCl₂.
   1. Peser 55,49 g de CaCl₂ anhydre et dissoudre dans 1 000 mL de HBS (20 mM d’HEPES et 150 mM de NaCl dans 1 000 mL d’eau déminéralisée).
   2. Filtre stérile à l’aide d’un filtre PES à pores de 0,22 μm.
3. Préparez 100 ml de mélange de dissolution.
   1. Préparer une solution saline tamponnée à 100 mM d’HEPES (23,83 g) et à 500 mM de citrate trisodique dihydraté (147,05 g).
   2. Ajustez à pH 7,4 à l’aide de NaOH ou de HCl.

2. Configuration du système d’encapsulation

1. Nettoyez la hotte à flux laminaire.
   1. Stériliser la hotte à flux laminaire contenant l’encapsulateur en utilisant une exposition aux UV suivie d’une pulvérisation d’une solution d’éthanol à 70 % v/v.
   2. Rincer le système d’encapsulation avec 10 mL de solution d’éthanol à 70 % v/v suivie de 10 mL d’eau désionisée stérile.
   3. Fixez la buse de 300 μm et répétez l’étape 2.1.2.
   4. Vaporisez le flacon contenant la solution d’alginate filtrée, le flacon contenant la solution de chlorure de calcium filtré et tous les outils, équipements et plaques de culture vides qui seront utilisés avec une solution d’éthanol à 70 % v/v et placez-les dans la hotte à flux laminaire. Avant utilisation, rallumez une lampe UV pendant 30 minutes pour bien stériliser.
   5. Préparez un bécher rempli d’une solution désinfectante de qualité biologique et placez le bécher dans la hotte.
   6. Remplissez un bécher avec 100 mL de solution stérile de CaCl₂ (aqueuse) et ajoutez-y un agitateur magnétique. Réglez la vitesse d’agitation à 100 tr/min. Placez le bécher sur une plate-forme magnétique à une hauteur de 18 cm de l’extrémité de la buse. Ce bécher servira à collecter les billes d’alginate et à permettre leur gélification.
2. Préparez les cellules pour l’encapsulation.
   1. Retirer les cellules de l’incubateur et les détacher de la fiole presque confluente à l’aide d’une solution d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % et incuber à 37 °C pendant 5 à 10 min.
   2. Isolez un échantillon pour estimer la densité cellulaire, puis centrifugez les cellules restantes à 1 000 tr/min pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
   3. Remettre la pastille en suspension dans l’HBS (20 mM HEPES et 150 mM de NaCl) pour doubler la concentration cellulaire finale souhaitée (p. ex., pour une concentration finale de 1,5 x 10⁶ cellules/mL, remettre les cellules en suspension dans l’HBS pour obtenir une concentration de 3 x 10⁶ cellules/mL).
   4. Dans un tube à centrifuger de 50 mL, mélanger la suspension cellulaire dans un rapport de 1:1 avec une solution d’alginate à ~4 % (p/v) pour obtenir une suspension finale contenant la concentration cellulaire souhaitée (p. ex., 1,5 x 10⁶ cellules/mL) dans une solution d’alginate à ~2 % (p/v).
3. Définissez les paramètres d’encapsulation.
   1. Réglez la vitesse de l’encapsulation sur la vitesse d’extrusion maximale (8,9 mL/min), la tension sur 1,0 kV et la fréquence sur 5 500 Hz.
      note: Ces paramètres ont été préalablement optimisés pour obtenir des microbilles de 550 μm de diamètre.

3. Fabrication

1. Fabriquez les microbilles.
   1. Dans une seringue de 20 ml, chargez 5 ml de suspension d’alginate cellulaire et fixez une seringue à l’encapsulateur.
   2. Démarrez l’encapsulateur en activant le flux qui poussera la suspension d’alginate cellulaire à travers le mangeoire. Un flux de gouttelettes sera extrudé à travers la buse.
   3. Recueillir les premiers 1 mL dans le bécher à déchets pour éviter le jet initial non uniforme.
   4. Continuez à faire couler les 4 ml restants en laissant les gouttelettes tomber dans le bain de gélification CaCl₂. Chaque millilitre peut être utilisé séparément (mais successivement) et recueilli dans quatre bains de gélification différents si nécessaire.
      note: Au contact du bain de gélification, l’alginate contenu dans les gouttelettes se réticulera instantanément avec les ions calcium du bain de gélification et formera des microbilles sphériques.
   5. Au bout d’une minute, retirez le bécher de gélification de la plate-forme magnétique et laissez les microbilles reposer pendant 4 minutes supplémentaires sans agitation (temps nécessaire pour permettre une gélification complète sur les microbilles à température ambiante).
2. Récupérer les microbilles.
   1. Retirez tous les gros débris ou artefacts d’alginate à l’aide d’une pince à épiler stérile, puis utilisez une pipette en plastique stérile pour transférer dans un filtre à mailles de 74 μm afin de récupérer les microbilles du bain de gélification.
   2. Transférez les microbilles dans un tube à centrifuger à l’aide du milieu de culture approprié et laissez-les s’équilibrer pendant 5 min dans le milieu de culture cellulaire.
   3. Transférer dans un ballon, une assiette ou une boîte de Pétri pour l’incubation et d’autres expériences.
      note: Le bain de gélification ne doit pas être réutilisé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.22 um PES filtre	Merck, Royaume-Uni	SLGP033RS
15mm Netwell insert 74 um filtre à mailles	Constar, États-Unis	#3477
Sel de sodium d’acide alginique d’algues brunes	Sigma-Aldrich,uk	A0682
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich,uk	C1016
CellTiter96 AQueous One Solution essai de prolifération cellulaire	Promega, États-Unis	G3580
Encapsulateur	Inotech	IE-50	N° de série 05.002.01-2005
HEPES	Sigma-Aldrich,uk	N° H4024
Saline tamponnée au phosphate	Sigma-Aldrich,uk	Réf. D1408
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich,uk	433209
Citrate de trispdium dihydraté	Sigma-Aldrich,uk	W302600-K
Solution trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich,uk	Réf. T4049