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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et l’examen vétérinaire JoVE
Remarque : Commencez par identifier la population murine cible. Dans des études antérieures, seules des souris mâles de type sauvage C57/Bl6 ont été utilisées. Cependant, diverses souris transgéniques ou knock-out peuvent également être utilisées. Notez que les coordonnées stéréotaxiques sont basées sur l’anatomie C57/Bl6. Il est recommandé que chaque utilisateur vérifie d’abord la localisation du trait sur la substance blanche.
1. Induction d’un trait de substance blanche - Approche angulaire médiale
- Commencez par préparer une pipette en verre tiré à l’aide d’un tube capillaire de 0,5 mm avec un diamètre distal compris entre 15 et 25 μm.
- Préparer une aliquote stérile de 10 μl de L-Nio (chlorhydrate de N(5)-(1)-iminoéthyl-L-ornithine) à 27,4 mg/ml (130 μM) dans une solution saline normale stérile à 0,9 %.
- Préremplissez la pipette en verre tiré avec un petit volume de L-Nio (2-5 μl) en fixant la pipette en verre sur un tube relié à une conduite de vide. Posez la pipette à plat sur le dessus de la paillasse et insérez l’extrémité tirée dans la solution L-Nio.
- Appliquez le vide jusqu’à ce qu’au moins 2 mm de la partie de 0,5 mm de la pipette soient remplis. Éteignez le vide et retirez la pipette. Mettez-le de côté jusqu’à l’étape 1.12.
- Placez la souris dans une chambre d’induction et induisez l’anesthésie de la souris à l’aide d’isoflurane standard à 32 % coulé dans un vaporisateur (5 L/min inhalés avec 5 L/min d’oxygène et 0,5 L/min d’azote) pendant 1 minute ou jusqu’à ce qu’elle soit profondément anesthésiée. Transférez la souris dans un appareil stéréotaxique équipé d’un microscope stéréotaxique. Fournir une anesthésie d’entretien à l’aide de 32 % d’isoflurane circulant dans un vaporisateur (2 L/min inhalés avec 5 L/min d’oxygène et 0,5 L/min d’azote) et un cône nasal. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement des orteils.
- Réglez le bras d’injection à 36°.
- Fixez un support de pipette en verre tiré à l’extrémité distale d’un système d’injection à pression de faible volume et fixez-le au bras d’injection de la configuration stéréotaxique.
- Enduisez les moustaches de l'animal anesthésié de vaseline et placez une pommade lacrymale artificielle sur les deux yeux. Préparez un champ chirurgical stérile en plaçant un champ stérile sur la tête de l'animal avec une ouverture de 5 à 10 cm au-dessus de la tête. Préparez une surface chirurgicale aseptique en rasant la fourrure recouvrant le crâne. Nettoyez le cuir chevelu avec une alternance de bétadine et de tampons d’alcool à 70 %.
- Faites une incision médiane de 1,5 cm du cuir chevelu avec des ciseaux fins stériles pour exposer la surface du crâne. Séchez le crâne à l’aide d’un coton-tige stérile et, à l’aide d’un microscope stéréotaxique à un grossissement de 1 à 3X, retirez tout tissu périosté sus-jacent à l’aide d’un outil micro-point stérile.
- Marquez le Bregma comme point de référence à l’aide d’un marqueur à pointe fine.
- Percez une craniotomie elliptique de 2 mm à l’aide d’un foret chirurgical stérile à pointe fine commençant vers l’arrière au niveau du Bregma et s’étendant vers l’avant juste à gauche de la ligne médiane. Retirez les fragments d’os et les tissus mous sus-jacents afin que le cortex cérébral puisse être visualisé.
- Gardez le champ opératoire et la surface corticale humides en appliquant par intermittence des gouttes de sérum physiologique.
- Fixez une pipette en verre tiré sur le bras d’injection de l’appareil stéréotaxique. Alignez l’extrémité distale de la pipette avec le Bregma et mettez à zéro les coordonnées stéréotaxiques.
- Avancez la pipette jusqu’aux premières coordonnées antérieure/postérieure (A/P) et médiale/latérale (M/L) fournies dans le tableau 1Tableau 1.
- Avancez la pipette jusqu’à la surface corticale et mettez à zéro la mesure dorsale/ventrale (D/V).
- Passez lentement la pipette dans le cerveau jusqu’à ce que vous atteigniez la première coordonnée D/V dans Tableau 1.
- À l’aide d’un système d’injection à faible pression réglé à 20 psi pour des impulsions de 20 ms, injectez 100 nl de L-Nio dans le cerveau et attendez 5 min pour éviter le reflux dans la piste de la pipette.
- Utilisez un réticule calibré dans l’oculaire du microscope stéréotaxique et un grossissement de 3X.
- En conséquence, décalez un total de 0,100 mm3 (longueur de 0,5 mm dans une pipette de 0,5 mm de diamètre, correspondant à 100 nl) de la pipette en verre tiré pour chaque ensemble de coordonnées. À l’aide d’un réticule, mesurez et standardisez puisque chaque configuration varie en fonction du grossissement et des échelles utilisées.
- Pour une mesure précise du volume lors de chaque injection, approchez la pipette inclinée avec le microscope sur le côté afin que le ménisque air-fluide ait une vue sagittale. Le ménisque doit apparaître dans le même plan focal des parois interne et externe de la pipette.
- Retirez lentement la pipette et répétez les étapes 1.13-1.16.3 aux deuxième et troisième séries de coordonnées fournies dans le tableau Tableau 1.
- Après l’injection finale, retirez la pipette et placez suffisamment de cire osseuse pour remplir le site de craniotomie. Approchez les bords de la plaie du cuir chevelu et liez-la avec de l’adhésif dermique.
- Injecter 0,1 ml de marcaine à 0,5 % dans les bords de la plaie à l’aide d’une aiguille stérile de 30 g pour prévenir les douleurs locales associées à l’incision du cuir chevelu.
- Remettez l’animal dans son logement et administrez-lui des antibiotiques postopératoires (0,48 mg/ml de triméthoprime-sulfaméthoxazole ou 0,5 mg/ml de lévofloxacine) dans l’eau de boisson pendant 5 jours.
