Détection d’interactions protéine-protéine chez les larves de drosophile à l’aide d’un test de ligature de proximité

Résumé

Source : Wang, S., et al. Détection de complexes protéine-protéine in situ à la jonction neuromusculaire larvaire de la drosophile à l’aide d’un test de ligature de proximité. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo montre la visualisation des interactions protéine-protéine à la jonction neuromusculaire de la drosophile (JNM) à l’aide du test de ligature de proximité (PLA). Après avoir isolé les parois du corps, les protéines en interaction sont sondées avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires conjugués au PLA. La proximité des protéines en interaction facilite la ligature des sondes avec des oligonucléotides connecteurs, formant de l’ADN circulaire, qui est ensuite amplifié par amplification en cercle roulant. Les sondes fluorescentes se lient à l’ADN amplifié, ce qui permet de visualiser les interactions protéine-protéine au niveau de la JNM.

Protocole

1. Préparation de la paroi corporelle

NOTE : La préparation des parois du corps des larves du troisième stade (pour l’étude des NMJ qui innervent les muscles de la paroi du corps) a été effectuée comme décrit précédemment, mais avec quelques modifications.

1. Dissection
   1. Élever les souches de mouches et les croisements à 25 °C pendant cinq à six jours en utilisant les procédures standard.
   2. Prélevez les larves rampantes du troisième stade dans des flacons ou des bouteilles à l’aide de pinces fines.
   3. Lavez les larves dans une petite boîte de Pétri contenant une solution saline tampon de phosphate (PBS) pour éliminer toute particule alimentaire.
   4. Placez une seule larve sur un disque sylgard et plongez-la dans quelques gouttes de PBS glacé. L’utilisation de PBS glacé aidera à étourdir la larve, ce qui facilitera sa manipulation. Tout au long de la dissection, assurez-vous que la préparation est toujours immergée dans du PBS pour éviter qu’elle ne sèche.
   5. Positionnez la larve avec sa face dorsale vers le haut de manière à ce que les deux voies trachéales soient visibles au microscope à dissection (Figure 1A). À l’aide de la pince pour saisir une épingle minutienne, épinglez la larve à l’extrémité postérieure près des spiracles (Figure 1B). Avec une autre épingle, percez la cuticule à l’extrémité antérieure près des crochets buccaux. Étirez doucement la larve dans le sens de la longueur, puis épinglez-la (Figure 1B).
   6. À l’aide de ciseaux de microdissection, pincez l’extrémité postérieure près de la goupille pour créer une petite ouverture. L’incision doit être suffisamment superficielle pour passer à travers la cuticule.
   7. En plaçant la pointe de la lame inférieure des ciseaux dans l’incision, coupez sur toute la longueur de la ligne médiane dorsale entre les deux voies trachéales (Figure 1C). Pointez les lames des ciseaux légèrement vers le haut lors de la coupe pour éviter d’endommager les muscles de la paroi ventrale du corps.
   8. Faites une petite incision horizontale légèrement en avant de la goupille placée vers l’arrière (Figure 1C). Faites une autre incision similaire légèrement en arrière de la goupille placée antérieurement (Figure 1C). Les incisions doivent simplement passer à travers la cuticule.
      REMARQUE : Les trois incisions des étapes 1.1.7 et 1.1.8 combinées doivent ressembler à un «  » une fois terminées, c’est-à-dire , un rabat gauche et droit sur le côté dorsal du corps larvaire doit être produit.
   9. Nettoyez soigneusement les organes internes à l’aide de la pince. L’ajout de quelques gouttes puissantes de PBS aidera à déplacer les organes hors du corps larvaire, ce qui facilitera leur retrait. Évitez de piquer le corps larvaire car cela causerait des dommages aux muscles de la paroi corporelle.
   10. Déployez le corps larvaire pour l’ouvrir et épinglez les coins (Figure 1D). Lors de l’épinglage, étirez la paroi corporelle horizontalement et verticalement pour former un rectangle uniformément tendu (voir Figure 1G pour la forme), en prenant soin de ne pas déchirer les muscles de la paroi corporelle dans le processus.
   11. Terminez l’ablation de tous les organes internes restants (Figure 1E).
2. Fixation et perméabilisation
   1. Immergez les parois du corps épinglées dans plusieurs gouttes de la Solution de Bouin. Incuber 15 min sur glace. Alternativement, utilisez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % comme fixateur alternatif ; Incuber pendant 30 min.
   2. Rincer trois fois avec un tampon phosphate salin avec triton (PBT).
   3. À l’aide d’une pince fine, retirez délicatement les goupilles et transférez les parois du corps par leurs coins dans un tube de microcentrifugation siliconé de 0,65 ml.
   4. Stockez les parois du corps dans du PBT à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le PLA. Pour des résultats optimaux, commencez l’immunocoloration des parois corporelles dans un jour ou deux après la dissection.
      NOTE : Pour économiser sur les réactifs et pour s’assurer que toutes les parois du corps sont traitées de manière égale pendant le test, différents génotypes peuvent être placés dans un seul tube. Les génotypes peuvent être distingués en coupant différemment les coins des parois du corps (voir Figure 1F par exemple).

2. Immunohistochimie

REMARQUE : L’immunocoloration des parois du corps larvaire du troisième stade a été réalisée comme décrit précédemment, mais avec quelques modifications.
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à température ambiante et en agitant doucement, sauf indication contraire.

1. Bloquant
   1. Lavez les parois du corps avec du PBT trois fois pendant 10 minutes chacune.
   2. Bloc avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h.
2. Immunomarquage
   1. Incuber les parois du corps avec des anticorps primaires de souris et de lapin contre les deux protéines d’intérêt (dilués dans 1 % de BSA) pendant 2 heures à température ambiante, ou toute la nuit à 4 °C. Dans ce cas, utilisez un anti-Dlg de souris 1:10 (Dlg = disques grands) et un anti-HtsM de lapin 1:250 (HtsM : Hu-li tai shao mutant). Des anticorps contre des marqueurs qui ne sont pas fabriqués chez la souris ou le lapin peuvent également être inclus - par exemple, utilisez 1:200 anti-Hrp de chèvre (Hrp = peroxydase de raifort) pour délimiter les membranes neuronales.
   2. Lavez avec du PBT trois fois pendant 10 minutes chacune.
   3. Incuber avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores pour détecter les marqueurs (dilués dans 1 % de BSA) pendant 2 heures à température ambiante, ou toute la nuit à 4 °C. Comme le signal PLA est visualisé plus tard avec un fluorophore rouge, un autre fluorophore doit être utilisé pour détecter le marqueur - par exemple , utilisez un anti-chèvre conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) 1:200 pour détecter l’anticorps anti-Hrp de chèvre. En raison de l’utilisation de réactifs sensibles à la lumière, gardez les tubes dans l’obscurité à partir de ce moment.
      REMARQUE : Le kit utilisé permet d’effectuer du PLA entre des anticorps primaires élevés chez la souris et le lapin, avec le signal visualisé sur le canal rouge sous microscopie confocale. Si vous le souhaitez, d’autres kits sont disponibles qui permettent de faire le test avec des anticorps primaires élevés chez d’autres espèces, et de visualiser le signal sur d’autres canaux.

3. Dosage de la ligature de proximité

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à température ambiante et en agitant doucement, sauf indication contraire.

1. Sondes PLA
   1. Lavez les parois du corps avec du PBT trois fois pendant 10 minutes chacune.
   2. Incuber avec des sondes PLA (dilution 1:5 chacune dans 1 % BSA) pendant 2 heures à 37 °C. Dans ce cas, utilisez 40 μl de sonde PLA anti-souris MINUS, 40 μl de sonde PLA anti-lapin PLUS et 120 μl de BSA à 1 % pour assurer une bonne immersion et un bon mélange de 5 à 10 parois du corps. Une dilution allant jusqu’à 1:25 des sondes PLA peut encore aboutir à un rapport signal/bruit adéquat (c’est-à-dire , pour cette expérience).
2. Ligature
   1. Lavez les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pendant 5 minutes chacune.
   2. Incuber avec la solution de ligature (dilution 1:40 de Ligase dans le tampon de ligature) pendant 1 heure à 37 °C. Dans ce cas, utilisez 5 μl de Ligase, 40 μl de tampon de ligature 5 et 155 μl d’eau de haute pureté pour assurer l’immersion et le mélange appropriés de 5 à 10 parois du corps.
3. Amplification
   1. Lavez les parois du corps avec le tampon de lavage A deux fois pendant 2 minutes chacune.
   2. Incuber avec une solution d’amplification (dilution 1:80 de la polymérase dans le tampon d’amplification) pendant 2 heures à 37 °C. Dans ce cas, utilisez 2,5 μl de polymérase, 40 μl de tampon d’amplification 5 et 157,5 μl d’eau de haute pureté pour assurer une immersion et un mélange corrects de 5 à 10 parois du corps.
4. Préparation à l’imagerie
   1. Lavez les parois du corps avec le tampon de lavage B deux fois pendant 10 minutes chacune.
   2. Laver avec le tampon de lavage B 0,01x une fois pendant 1 min.
   3. Équilibrez en quelques gouttes de solution de montage pendant au moins 30 minutes avant le montage, ou stockez-le pendant la nuit à 4 °C.
   4. À l’aide d’une pince fine, transférez soigneusement les parois du corps sur une plate-forme coulissante avec leurs cuticules vers le bas. Positionnez les parois du corps en rangées et dans la même orientation à l’intérieur d’une goutte ou deux de montaison. Placez une lamelle de 22 mm x 40 mm sur la préparation en prenant soin de ne pas générer de bulles d’air, puis scellez la lame avec du vernis à ongles transparent.
   5. Stockez les lames dans l’obscurité à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie confocale.

Résultats

Figure 1 : Préparation des parois du corps larvaire du troisième stade. (A-F) Dessins schématiques représentant une dissection de la paroi du corps. (A) Placez une seule larve sur un disque sylgard avec sa face dorsale vers le haut de sorte que les deux voies trachéales soient visibles. (B) Épinglez la larve aux extrémités antérieure et postérieure avec des épingles ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Forceps (bien #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mélangez la base élastomère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Laisser reposer pendant 30 min. Verser dans un moule (par exemple, utiliser une plaque de culture cellulaire à 12 puits). Laisser durcir pendant au moins 24 heures. Collez le couvercle d’une boîte de Pétri de 60 x 15 mm lors de la dissection.
Goupilles Minutien (0,0125 mm de diamètre de pointe)	Outils scientifiques fins	26002-10
Ciseaux de microdissection (ultra fins)	Outils de sciences fines	15200-00
Diapositives de plate-forme			Collez deux lamelles de 22 x 22 mm sur une lame de microscope avec du vernis à ongles transparent, en laissant un espace de < 20 mm entre les deux pour le montage de l’échantillon.
w1118	Centre de stock de drosophile de Bloomington	3605
HTS01103	Centre de stock de drosophile de Bloomington	10989	La crosse a été rééquilibrée sur un équilibreur GFP afin que les mutants homozygotes puissent être sélectionnés en fonction de l’absence de signal GFP.
1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate) : 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
La solution de Bouin	Sigma-Aldrich	HT10132
4 % PFA (paraformaldéhyde) : 4 % PFA dans 1x PBS			PFA (Anachemia Science - 66194-300). Voir doi :10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 pour des instructions sur la façon de faire la solution.
1x PBT (solution saline tamponnée au phosphate avec triton) : 1x PBS avec 0,01 % de triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1 % BSA (albumine sérique bovine) : 1 % BSA dans 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Conserver à 4 °C.
souris anti-Dlg (Disques grands)	Etudes développementales Hybridoma Bank	4F3	Utiliser à une dilution de 1:10 dans 1 % BSA.
lapin anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Fourni par le Dr Lynn Cooley (Université Yale). Utiliser à une dilution de 1:250 dans 1 % BSA.
lapin anti-Pak (kinase activée par p21)			Fourni par le Dr Nicholas Harden (Université Simon Fraser). Utiliser à une dilution de 1:500 dans 1 % BSA.
souris anti-Wg (sans ailes)	Etudes développementales Hybridoma Bank	4D4	Utiliser à une dilution de 1:5 dans 1 % BSA.
capri anti-Hrp (Raifort peroxydase)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Utiliser à une dilution de 1:200 dans 1 % BSA.
Anti-chèvre âne conjugué au FITC	Jackson ImmunoResearch	705-095-003	Utiliser à une dilution de 1:200 dans 1 % BSA.
Sonde PLA in situ Duolink anti-souris MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Sonde PLA in situ Duolink anti-lapin PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Réactifs de détection in situ Duolink Rouge	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x tampon de lavage A : 0,01M Tris, 0,15M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x tampon de lavage B : 0,2 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratoires Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Tampon de lavage B : 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratoires Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Support de montage in situ Duolink avec DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040