Détermination de la capacité de rétention calcique des mitochondries isolées

Résumé

Source : Li, W., et. al. Dosage de la capacité de rétention mitochondriale Ca2+ et dosage du gonflement mitochondrial déclenché par le Ca2+. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre la procédure d’évaluation de la capacité de rétention du calcium mitochondrial en surveillant les changements en temps réel de la fluorescence lorsque les mitochondries absorbent le calcium. Ce test est utile pour étudier la fonction mitochondriale et les processus liés au calcium, y compris l’apoptose et les maladies neurodégénératives.

Protocole

1. Détermination de la capacité de rétention mitochondriale Ca²⁺

1. Préparez le milieu KCl (125 mM KCl (chlorure de potassium), 2 mM K₂HPO₄ (phosphate dipotassique), 1 mM MgCl₂ (chlorure de magnésium), 20 mM HEPES (acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-yl]éthanesulfonique), 5 mM de glutamate, 5 mM de malate et 2 μM de roténone, pH 7,4) et ajoutez le colorant fluorescent vert liant Ca²⁺ à une concentration finale de 0,5 μM avant l’expérience.
2. Transvaser 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans un milieu KCl contenant 0,5 μM de colorant fluorescent vert liant 0,5 μM Ca²⁺ dans chaque puits de plaque à 6 puits.
3. Incuber les mitochondries et le colorant fluorescent vert de liaison Ca²⁺ dans la plaque à 6 puits à température ambiante, à l’abri de la lumière ambiante pendant 1 min. Ajouter 4 μL d’aliquotes d’une solution de 20 mM de CaCl₂ (20 mM de CaCl₂, 127 mM de KCl, 1 mM de MgCl_2, 20 mM d’HEPES, 5 mM de glutamate, 5 mM de malate, pH 7,4) à chaque puits de plaque à 6 puits à l’aide du réglage de distribution automatique pour introduire 200 nmol de Ca²⁺/mg de protéine mitochondriale.
4. À l’aide d’un spectromètre de fluorescence, vous pouvez surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pendant 2 minutes avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nm et une longueur d’onde d’émission de 531 nm. La plaque est équipée d’une secousse à 600 tr/min pendant 3 s entre les lectures contrôlées par logiciel (Figure 1).
5. Ajouter une aliquote supplémentaire de 4 μL de solution de CaCl₂ dans chaque puits et surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pendant 2 min. Répétez cette étape jusqu’à ce que la fluorescence augmente avec le temps.
   REMARQUE : Les mitochondries sont mises au défi avec l’ajout de Ca²⁺ indiqué par l’augmentation de la fluorescence d’enregistrement. Lorsque le mPTP (pore de transition de perméabilité mitochondriale) s’ouvre, la fluorescence augmente avec le temps.
6. Interprétez la quantité totale de Ca²⁺ ajoutée jusqu’à l’ouverture du mPTP en tant que capacité de rétention Ca²⁺.

Résultats

Figure 1 : Paramètres logiciels pour le test de capacité de rétention mitochondriale Ca²⁺.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vert de calcium-5N	Technologies de la vie	C-3737	Colorant fluorescent vert liant le calcium
Glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
Malate	Sigma-Aldrich	46940-U
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	N° H3375
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	457
Phosphate dipotassique	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Chlorure de calcium	Sigma-Aldrich	V900266