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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des systèmes de perfusion par pompe micro-osmotique
REMARQUE : Préparez la pompe, le tampon de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) et le médicament (solution protéique Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL dans aCSF)) dans des conditions stériles à l’aide de tampons filtrés avec des filtres de 0,2 μm et effectuez toutes les procédures sous le capot de culture avec des gants. Les procédures chirurgicales se déroulent comme suit :
- Préparez les pompes micro-osmotiques un jour avant l’intervention chirurgicale : Remplissez la pompe micro-osmotique cérébrale avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) avec une seringue de 1 ml et une aiguille à tête émoussée fournies avec le kit. Immergez la pompe micro-osmotique dans un LCR et placez-la sur un agitateur en l’agitant doucement pendant la nuit.
ATTENTION : La pompe doit être remplie d’aCSF et les bulles d’air doivent être évitées à l’intérieur de la pompe (Figure 1A).
- Avant de commencer l’opération, préparez la solution recombinante de la protéine Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, diluée dans un LCR) pour l’expérience. Retirez l’aCSF de la pompe et remplissez lentement la pompe avec la solution médicamenteuse jusqu’à ce que l’excès s’échappe.
REMARQUE : 15 mL de solution aCSF ou Met-CCL5/RANTES sont suffisants pour 5 à 8 pompes.
ATTENTION : Répétez la procédure pour vous assurer que la pompe est complètement remplie avec le médicament sans bulles à l’intérieur.
- Coupez les tubes du cathéter à la longueur souhaitée et fixez-les à l'aiguille de perfusion cérébrale à extrémité émoussée du kit de perfusion cérébrale. Remplissez le kit de perfusion et les tubes avec le médicament.
- Enfin, assemblez et fixez le kit de perfusion cérébrale à la pompe micro-osmotique.
ATTENTION : Aucune bulle ne doit se former dans le tube ou la pompe (Figure 1A).
- Immergez l’ensemble de la fusion osmotique-cerveau dans un tube stérilisé de 50 mL pour éviter que la pompe ne se dessèche. Le kit de fusion osmotique-cerveau est maintenant prêt à être utilisé pour la chirurgie.
REMARQUE : Les systèmes de pompe micro-osmotique peuvent être utilisés pour la perfusion de médicaments à long terme. Cela garantit un mode sûr et pratique d’administration du médicament dans le cerveau de la souris.
2. Chirurgie ventriculaire intracérébrale – implantation de la pompe micro-osmotique
ATTENTION : Stérilisez l’environnement chirurgical avec de l’éthanol à 75 % et assurez-vous que les personnes participant à l’étude portent des gants stériles et une blouse de laboratoire propre. Les outils/instruments chirurgicaux doivent être autoclavés et séchés avant d’être utilisés, puis stérilisés avec de l’éthanol à 75 % entre les chirurgies de souris.
- Pesez la souris et anesthésiez-la à l’aide d’une injection intra-péritonéale (IP) avec de la kétamine/xylazine (kétamine 50 mg/kg, xylazine 10 mg/kg).
ATTENTION : Les souris dont le poids corporel est inférieur à 24 g ne sont pas recommandés pour la chirurgie d’implantation de pompe osmotique.
- Montez et fixez la tête de la souris sur l’appareil stéréotaxique (Figure 1B).
- Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux et de pinces pour ouvrir la peau externe recouvrant le crâne. Utilisez de l’iode pour nettoyer le crâne périphérique.
- Séparez la couche la plus externe de la peau sous-cutanée à l’aide d’une paire de pinces à tête émoussée près de la région du cou pour l’implantation de l’ensemble de fusion osmotique-cerveau (Figure 1C).
- Marquez le point de perfusion par rapport à la carte cérébrale (Figure 1D) à l’aide de l’appareil stéréotaxique. Dans cette expérience, l’aiguille doit être implantée dans la 3e région du ventricule (Bregma : 0,0 mm latéral, 1,3 mm postérieur, 5,7 mm ventral).
- Percez un trou à l’aide d’une perceuse à ongles autour de la zone marquée sur le crâne (Figure 1E).
ATTENTION : Veillez à ne pas casser les méninges et les vaisseaux sanguins de la souris, évitant ainsi de perturber les micro-vaisseaux sanguins du cerveau.
- Placez l’ensemble de fusion micro-osmotique pompe-cerveau contenant un LCR (comme témoin) ou un médicament (solution protéique Met-CCL5/RANTES) sous la peau derrière la région du cou et insérez l’aiguille de perfusion cérébrale dans le trou percé pour infuser le médicament dans le cerveau de la souris (Figure 1E). L’aiguille pénétrera dans les méninges et pénétrera dans le ventricule. Fixez l’aiguille en place sur le crâne à l’aide d’un gel désensibilisant de surface (Figure 1F) et attendez 1 à 2 minutes jusqu’à ce que la colle sèche. Ensuite, coupez la partie saillante au-dessus de l’aiguille (Figure 1G-H).
- Utilisez une colle adhésive pour tissus pour cicatriser la plaie de l’opération sur la tête. Appliquez 50 μL de colle sur le dessus de la plaie, rapprochez les deux côtés de la peau et maintenez pendant 30 s pour permettre à la peau de se sceller (Figure 1I).
ATTENTION : Utilisez un tampon d’alcool à 100 % pour nettoyer la plaie après la chirurgie et 100 ul de pénicilline avec streptomycine pour prévenir l’infection. note: La peau de souris formera du tissu cicatriciel et guérira en quelques jours suite à l’administration de la colle chirurgicale. Le principal avantage de la colle est d’éviter les points de suture chirurgicaux, qui peuvent provoquer une irritation ou une inflammation de la peau.
- Placez la souris dans une cage propre maintenue sur une plaque chaude (chauffée à 37 °C) et attendez que la souris se remette de l’effet anesthésique.
ATTENTION : Il est essentiel de maintenir la température corporelle de la souris pour augmenter les chances de survie après la chirurgie.
- Après une période de récupération d’une semaine, les souris seront prêtes pour d’autres expériences, telles que le test de tolérance au glucose oral (OGTT) et le test de tolérance à l’insuline (ITT).
3. Test de tolérance au glucose par voie orale (OGTT)
REMARQUE : Effectuer le test de tolérance au glucose par voie orale 7 jours après la perfusion d’aCSF et de MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 μL). Maintenez un jeûne de 6 h pour les souris avant l’OGTT avec un apport d’eau suffisant. Gardez les animaux sur le même banc de travail où les expériences seront effectuées afin qu’ils puissent s’acclimater à l’environnement pour réduire le stress pendant la procédure.
- Préparation de la solution de glucose : Avant de réaliser l’expérience, préparez la solution de glucose en dissolvant 3,75 g de glucose dans 15 mL de H2O distillé.
- Établissez un calendrier pour enregistrer les valeurs mesurées pendant la procédure expérimentale (tableau 1).
REMARQUE : Il est important d’établir un calendrier avec des intervalles appropriés entre chaque examen sanguin pour permettre un enregistrement précis pendant l’expérience.
- Pesez chaque souris après le jeûne et calculez la quantité appropriée de glucose à injecter. Par exemple, si la souris pèse 30 g, la quantité de solution de glucose à administrer doit être de 300 μL.
- Préparez les instruments suivants sur l’établi :
- Glucomètre (Appuyez sur le bouton de démarrage pour vérifier l’état de la batterie ; assurez-vous qu’elle fonctionne avant le test.)
- Puce de glucose
- Seringue à insuline (seringue à insuline de 0,3 ml)
- Lames de rasoir
- minuteur
- Une fois le banc installé, mesurez et enregistrez le taux de glucose dans le sang comme suit : Mettez une puce de glucose propre et neuve dans le glucomètre et appuyez sur le bouton de démarrage pour la mettre à zéro.
- Prenez la souris par l’arrière du cou et caressez la queue plusieurs fois pour assurer un flux sanguin suffisant vers la région de la queue.
- À l’aide d’une nouvelle lame de rasoir, coupez un petit morceau de la queue et pressez une petite goutte de sang (environ 10 à 20 μL) dans la puce de glucose. Le sang doit remplir la puce pour permettre une mesure précise. Le glucomètre affichera immédiatement le taux de glucose. Si l’appareil affiche une « erreur », répétez la procédure avec une nouvelle puce de glucose.
REMARQUE : La puce de glucose ne nécessite qu’une seule goutte de sang. Lorsque l'échantillon de sang doit être prélevé plus d'une fois, il suffit d'appliquer une pression en passant vos doigts le long de la queue de la souris plusieurs fois tout en tenant l'extrémité de la queue directement sur le dessus de la puce pour recueillir le sang. Il n’est pas nécessaire de couper l’extrémité de la queue à chaque fois lors du prélèvement d’échantillons de sang.
- Ensuite, donnez aux souris du glucose (0,25 g/mL) par voie orale en utilisant la technique du gavage intragastrique. La quantité de glucose à administrer doit être calculée à l’aide de la formule : 10X poids corporel (poids corporel) μL de solution de glucose (par exemple, si la souris pèse 30 g, la quantité de solution de glucose à administrer sera de 300 μL). Démarrez la minuterie immédiatement après l’administration de glucose par voie orale.
- Répétez la procédure de mesure de la glycémie à 15, 30, 60, 90 et 120 min.
- Une fois que toutes les lectures de glycémie ont été enregistrées, jetez les lames de rasoir et les puces de glucose dans un récipient à risque biologique. Remettez la nourriture dans les cages des souris et retournez-les dans la salle des animaux.
Table 1. Calendrier d’enregistrement du test de tolérance au glucose oral (OGTT)
| # | ID de souris | corps | glucose | commencer | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| | poids | μL = 10 x p.c. | Heure | Minutes | Minutes | Minutes | Minutes | Minutes |
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | 9 h 00 | 9 h 00 | 9 h 00 | 9 h 15 | 9 h 30 | 10 h 00 |
| deux | 502 | 25,3 grammes | 253 | 9 h 07 | 9 h 07 | 9 h 07 | 9 h 22 | 9 h 37 | 10:07 |
