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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des lames et des tissus
- Utilisez des lames de préparation au silane ou des lames de verre à membrane de polyéthylène naphtalate (PEN).
- Pour l’isolement de l’ARN, trempez les lames dans une solution de décontamination RNase, lavez-les 3 fois avec de l’eau sans RNase, puis déshydratez-les avec une série graduée d’éthanol sans RNase et faites-les sécher sous vide pendant 30 min.
- Coupez des coupes de tissu à 10 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et montez-les sur les lames libres RNase préparées. Conservez les sections congelées pendant la section pour préserver la qualité de l’ARN. REMARQUE : Assurez-vous que le tissu est à environ 4 mm des bords de la lame, car le LCM ne peut pas enlever le tissu qui est trop près des bords de la lame. Afin de retirer du tissu d’une lame à membrane PEN, assurez-vous que le tissu se trouve à 4 mm de la gauche, en haut et en bas et à 7 mm du côté droit de la lame, qui sont les dimensions de la membrane qui n’est pas fixée à la lame.
- Pour isoler des populations cellulaires individuelles à l’aide de l’immunohistochimie directe, sectionner le tissu sur les lames de Silane-prep ou sur les lames de membrane PEN. Pour isoler des régions de tissu à l’aide de techniques guidées par immunohistochimie indirecte, montez un ensemble de coupes sur une lame Silane-prep pour l’immunohistochimie et des coupes alternées sur une lame à membrane PEN et/ou une lame Silane-prep à utiliser pour la LCM.
2. Préparation des tissus pour la capture laser – Immunohistochimie rapide de la tyrosine hydroxylase pour la capture laser directe des cellules immunoréactives
- Tracez le contour des tissus avec un stylo hydrophobe et laissez sécher.
- Fixer le tissu dans une solution d’acétone-méthanol (1:1) à -20 °C pendant 10 min. REMARQUE : Notre expérience a montré que la fixation acétone-méthanol a entraîné une immunohistochimie beaucoup plus cohérente que l’acétone ou le méthanol seuls.
- Rincez la lame dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % de Triton (sans RNase).
- Couvrir les sections avec 100-200 μl de PBS avec 1 % de Triton avec anticorps anti-tyrosine hydroxylase dilué 1:100 avec 400 U/ml de RNasin. Incuber pendant 5 à 10 min.
- Rincez brièvement deux fois avec du PBS et du PBS-1 % Triton.
- Couvrir le tissu avec 100 à 200 μl d’IgG anti-lapin de chèvre marqués avec Alexa Fluor 488 dilués 1:100 dans du PBS-1 % Triton avec 400 U/ml de RNasin et 50 ng/ml de DAPI. Incuber pendant 5 min.
- Rincez 2 fois dans du PBS puis déshydratez 30 s dans une série graduelle d’éthanol sans RNase (75 %-75 %-95 %-95 %-100 %-100 %).
- Incuber en deux lavages de xylène pendant 1 min, puis 5 min.
- Retirez les lames de xylène immédiatement avant de l’utiliser pour le LCM et laissez-les sécher à l’air.