Immunohistochimie de coupes de tissu cérébral de souris pour cibler les neurones dopaminergiques

Résumé

Source : Kummari, E., et. al., Microdissection par capture laser - Une démonstration de l’isolement des neurones dopaminergiques individuels et de l’ensemble de l’aire tegmentale ventrale., J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous démontrons le protocole d’immunohistochimie pour les neurones dopaminergiques dans les coupes de tissus cérébraux pour la microdissection ultérieure par capture laser.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation des lames et des tissus

1. Utilisez des lames de préparation au silane ou des lames de verre à membrane de polyéthylène naphtalate (PEN).
2. Pour l’isolement de l’ARN, trempez les lames dans une solution de décontamination RNase, lavez-les 3 fois avec de l’eau sans RNase, puis déshydratez-les avec une série graduée d’éthanol sans RNase et faites-les sécher sous vide pendant 30 min.
3. Coupez des coupes de tissu à 10 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et montez-les sur les lames libres RNase préparées. Conservez les sections congelées pendant la section pour préserver la qualité de l’ARN. REMARQUE : Assurez-vous que le tissu est à environ 4 mm des bords de la lame, car le LCM ne peut pas enlever le tissu qui est trop près des bords de la lame. Afin de retirer du tissu d’une lame à membrane PEN, assurez-vous que le tissu se trouve à 4 mm de la gauche, en haut et en bas et à 7 mm du côté droit de la lame, qui sont les dimensions de la membrane qui n’est pas fixée à la lame.
4. Pour isoler des populations cellulaires individuelles à l’aide de l’immunohistochimie directe, sectionner le tissu sur les lames de Silane-prep ou sur les lames de membrane PEN. Pour isoler des régions de tissu à l’aide de techniques guidées par immunohistochimie indirecte, montez un ensemble de coupes sur une lame Silane-prep pour l’immunohistochimie et des coupes alternées sur une lame à membrane PEN et/ou une lame Silane-prep à utiliser pour la LCM.

2. Préparation des tissus pour la capture laser – Immunohistochimie rapide de la tyrosine hydroxylase pour la capture laser directe des cellules immunoréactives

1. Tracez le contour des tissus avec un stylo hydrophobe et laissez sécher.
2. Fixer le tissu dans une solution d’acétone-méthanol (1:1) à -20 °C pendant 10 min. REMARQUE : Notre expérience a montré que la fixation acétone-méthanol a entraîné une immunohistochimie beaucoup plus cohérente que l’acétone ou le méthanol seuls.
3. Rincez la lame dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % de Triton (sans RNase).
4. Couvrir les sections avec 100-200 μl de PBS avec 1 % de Triton avec anticorps anti-tyrosine hydroxylase dilué 1:100 avec 400 U/ml de RNasin. Incuber pendant 5 à 10 min.
5. Rincez brièvement deux fois avec du PBS et du PBS-1 % Triton.
6. Couvrir le tissu avec 100 à 200 μl d’IgG anti-lapin de chèvre marqués avec Alexa Fluor 488 dilués 1:100 dans du PBS-1 % Triton avec 400 U/ml de RNasin et 50 ng/ml de DAPI. Incuber pendant 5 min.
7. Rincez 2 fois dans du PBS puis déshydratez 30 s dans une série graduelle d’éthanol sans RNase (75 %-75 %-95 %-95 %-100 %-100 %).
8. Incuber en deux lavages de xylène pendant 1 min, puis 5 min.
9. Retirez les lames de xylène immédiatement avant de l’utiliser pour le LCM et laissez-les sécher à l’air.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95 % Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100 % Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Anticorps anti-tyrosine hydroxyase	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG	Life Technologies, Grand Island, État de New York	A-11008
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, État de New York	AM9780

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