Étude du trafic des protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile

Résumé

Source : Wagner, K. et al., Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo montre la visualisation du trafic des protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines TRPL marquées eGFP. Il détaille la préparation des mouches transgéniques pour l’imagerie, la capture d’images de fluorescence des cellules photoréceptrices et la quantification du trafic de TRPL en mesurant la fluorescence eGFP relative dans les rhabdomères.

Protocole

1. Considérations générales

1. Utilisez des stocks de Drosophila exprimant des protéines de translocation situées en permanence rhabdoméralement pour des analyses concernant le trafic de protéines (par exemple, canal ionique de type potentiel de récepteur transitoire (TRPL) :: protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), arrestine 2 (Arr2) ::eGFP).
2. Prédéterminer les conditions d’exposition à la lumière des mouches sélectionnées pour l’approche expérimentale.
   1. Pour une adaptation à l’obscurité, conservez les mouches dans des boîtes sombres pendant la période souhaitée à 25 °C. Pour un éclairage jusqu’à 16 h dans les expériences de translocation (par exemple, TRPL ::eGFP exprimant des mouches), gardez les mouches sous un tube fluorescent à température ambiante.
   2. Pour éclairer les mouches avec une lumière colorée, utilisez des boîtes en plastique transparent de différentes couleurs avec le tube fluorescent.

2. Microscopie à immersion dans l’eau

1. Préparation des mouches
   1. Préparez l’espace de travail avec l’équipement et les réactifs nécessaires, comme indiqué dans Figure 1. Transférez les mouches dont l’âge et les conditions d’éclairage sont prédéterminés dans un tube à centrifuger prérefroidi de 15 ml et anesthésiez-les en les incubant sur de la glace pendant 15 à 30 minutes.
      REMARQUE : Emportez des mouches âgées de 1 jour, adaptées à l’obscurité comme référence. Généralement, les mouches adaptées à l’obscurité doivent être transférées dans une glacière avec un couvercle dans l’obscurité. Les mouches adaptées à la lumière peuvent être transférées sur la glace à la lumière ambiante.
   2. Transférez une mouche anesthésiée à la glace la tête la première dans une pointe de pipette de 200 μL et poussez la mouche vers la pointe avec précaution avec de l’air comprimé.
   3. Coupez la pointe de la pipette juste devant la tête à l’aide d’un scalpel. À l’aide d’une pince à épiler, poussez délicatement la mouche à quelques millimètres de la pointe. Coupez à nouveau la pointe de la pipette et repoussez la mouche vers la pointe avec de l’air comprimé de sorte que seule la tête de la mouche dépasse de la pointe de la pipette.
   4. Collez un morceau de pâte à modeler sur une lame d’objet et enfoncez la pointe de la pipette de manière à ce que l’œil gauche ou droit de la mouche soit tourné vers le haut (Figure 2A). Juste avant l’acquisition de l’image, utilisez une pipette de laboratoire pour coller une grosse goutte d’eau glacée sur la face inférieure d’un objectif d’immersion dans l’eau (Figure 2B). Passez immédiatement à l’acquisition d’images pour de meilleurs résultats.
      REMARQUE : Un retard important dans l’acquisition de l’image entraîne un réveil et des mouvements de la mouche qui peuvent conduire à des images floues.
      
2. Acquisition d’images
   1. Placez soigneusement la lame de l’objet avec la mouche préparée sur la platine du microscope et sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau.
   2. Abaissez manuellement l’objectif d’immersion dans l’eau jusqu’à ce que l’œil de la mouche touche la goutte (Figure 3A, B).
   3. Allumez la lampe UV du microscope et sélectionnez le jeu de filtres approprié. Utilisez les oculaires pour positionner la mouche sous l’objectif et focaliser le microscope sur la surface de l’œil.
   4. Basculez le trajet de la lumière vers la caméra du microscope et générez une image en direct dans le logiciel correspondant. Réajustez la mise au point de l’appareil photo et évaluez l’orientation de l’œil, en tenant compte du fait que l’œil doit faire face radialement à l’objectif du microscope, comme illustré plus en détail dans Figure 3C-E.
   5. Utilisez la LUT (table de recherche) appropriée dans le logiciel d’imagerie pour détecter la sursaturation (indiquée par des pixels rouges).
   6. Dans le cas des mouches non pigmentées, ajustez le temps d’exposition de sorte que les pixels les plus brillants soient juste en dessous de la limite de saturation pour chaque image.
   7. Enregistrez une image et enregistrez-la en tant que fichier brut pour archiver toutes les métadonnées correspondantes de l’enregistrement. Exportez l’image dans un format .tif pour la quantification suivante.
      REMARQUE : Illuminez les mouches pendant 5 minutes avec une lumière rouge (par exemple, 630 nm) immédiatement après l’acquisition de l’image, si elles sont destinées à être utilisées pour d’autres expériences. La lumière rouge désactive la cascade de phototransduction qui a été activée de manière excessive par la lumière intense à ondes courtes lors de l’acquisition de l’image.
      
3. Analyse des données et quantification de la fluorescence eGFP relative dans les rhabdomères des micrographies à immersion dans l’eau
   1. Téléchargez, installez et exécutez le logiciel ImageJ/Fiji.
   2. Ajustez les paramètres d’ImageJ en cliquant sur Analyser > définir les mesures... et cochez uniquement la case Valeur de gris moyenne. Importez une image .tif en cliquant sur Fichier > Ouvrir... ou par glisser-déposer. Choisissez une zone représentative de l’image qui est nette et agrandissez-la à 200 %-300 % en appuyant plusieurs fois sur Ctrl et +.
   3. Sélectionnez l’outil Ovale et, tout en appuyant sur la touche Shift , générez une sélection circulaire dans l’image qui est nettement plus petite qu’un rhabdomère fluorescent. Avant de relâcher le bouton de la souris, recherchez la taille exacte affichée sous la barre d’outils dans la fenêtre principale d’ImageJ. Utilisez la même taille de sélection circulaire pour toutes les analyses.
      REMARQUE : La taille exacte de la sélection circulaire en pixels ou en microns dépend de la configuration spécifique. Utilisez un cercle d’environ 1/3 ou 1/4 du diamètre rhabdomère des mouches témoins d’un jour adaptées à l’obscurité.
   4. Déplacez la sélection circulaire soit en cliquant dessus avec la souris et en la faisant glisser, soit en appuyant sur les touches fléchées du clavier.
   5. Pour mesurer les intensités de fluorescence dans la sélection circulaire, déplacez le cercle vers le premier rhabdomère (r1) et cliquez sur Analyser > mesurer ou utilisez le raccourci Ctrl + M. Une fenêtre Result listant la valeur de gris mesurée apparaîtra.
   6. Passez aux mesures de r2-r6 sous forme de mesures répétées et à une mesure du signal de fond (b). Dans le cas des mouches non pigmentées, effectuez des mesures supplémentaires des zones corporelles cellulaires correspondantes (c1-c6) (Figure 4).
   7. Répétez les étapes 2.3.5 et 2.3.6 pour deux autres ommatidies, ce qui donne trois répétitions techniques. Marquez les ommatidies analysées à l’aide de l’outil Crayon et enregistrez cette image pour la documentation.
   8. Sélectionnez et copiez les valeurs de gris mesurées à partir de la fenêtre Résultat et collez-les dans un tableur pour des calculs ultérieurs. Triez les valeurs de l’intensité de fluorescence en fonction de leur origine dans les catégories rhabdomère (r), corps cellulaire (c) et arrière-plan (b). Calculez l’intensité moyenne de chaque catégorie (Ir, Ic, Ib).
   9. Calculez la quantité relative d’eGFP présente dans le rhabdomère.
   10. Passez à l’image suivante à l’étape 2.3.3. Il est recommandé d’utiliser des images d’au moins cinq individus de chaque groupe expérimental comme réplicats biologiques pour obtenir une mesure fiable.

Résultats

Figure 1 : Espace de travail pour la microscopie à immersion dans l’eau. Les matériaux nécessaires sont les suivants : (A) tube à centrifuger de 15 ml, flocons de glace (B), (C) eau distillée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
15 mL centrifuge tube	Greiner Bio-One	188271
Coussin anti-mouches pour anesthésie au dioxyde de carbone	Flystuff	59-172
Lampe à lumière froide (KL 1500 LCD)	Zeiss
Fiji/ImageJ	NIH
Microscope à fluorescence avec lampe UV, caméra, jeu de filtres et logiciel (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)	Zeiss	<
Tube fluorescent	Osram	4050300518039.00
Pipette de laboratoire (20-200 μL)	Eppendorf	<
Object slide	Roth	656.1
Pointes de pipette (200 μL)	Labsolute	7695844
Plasticine (Blu-Tack)	Bostik	30811745
Stereo microscope (SMZ445)	Nikon
Stereomicroscope avec lampe UV, appareil photo, ensemble de fichiers et logiciel (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)	Leica

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