Détection des modifications des histones dans les cellules de levure avec surexpression de protéines neurodégénératives

Résumé

Source : Bennett, S. A., et al., Caractérisation des altérations de modification post-traductionnelle des histones dans les modèles de protéinopathie neurodégénérative de levure. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre la procédure d’évaluation des modifications des histones dans les cellules de levure surexprimant les protéines neurodégénératives. Les étapes comprennent la lyse cellulaire, la centrifugation, l’électrophorèse, le transfert membranaire et la détection d’histones modifiées à l’aide d’anticorps.

Protocole

1. Lyse cellulaire et western blot pour détecter les modifications

1. post-traductionnelles des histonesLyse cellulaire
   1. < span style='background-color :transparent ;color :#1a202c ;'>Décongelez les pastilles de cellules de levure sur de la glace et remettez-les en suspension dans 100 μL de dH₂O.
   2. À la remise en suspension de la cellule, ajoutez 300 μL de NaOH 0,2 M et 20 μL de 2-mercaptoéthanol. Remettre en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas.
   3. Incuber des cellules sur de la glace pendant 10 min, puis les centrifuger à 3 200 x g sur une centrifugeuse de table pendant 30 s à RT. Jeter le surnageant.
   4. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 μL de 1x colorant de chargement et faire bouillir pendant 10 min sur un bloc chauffant.
      REMARQUE : La recette de 6x chargement de colorant se trouve dans la Table des matériaux.
2. Électrophorèse et transfert de membrane de gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide
   1. Préparez la chambre de gel en plaçant deux gels dans un support de gel, en remplissant la chambre intérieure jusqu’en haut avec un tampon de coulage et en remplissant la chambre extérieure jusqu’à la marque de ligne de deux gels.
   2. Chargez 15 μL d’échantillon par puits dans un gel de polyacrylamide à 10 puits à 12 %. Pour la voie de l’échelle protéique, chargez 5 μL.
   3. Faites fonctionner le gel pendant environ 45 minutes à 150 V, ou jusqu’à ce que la face du colorant de chargement atteigne le bas du gel.
   4. Pendant que le gel fonctionne, préparez-vous pour le transfert membranaire en trempant des tampons de fibres (deux par gel) dans un tampon de transfert (Table des matériaux) et en trempant la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) dans du méthanol. Rincez la membrane dans le tampon de transfert avant le transfert.
      REMARQUE : La membrane PVDF doit être coupée à la taille du gel et utiliser une membrane PVDF pour chaque gel transféré.
   5. Assemblez, sur une cellule d’appareil de transfert semi-sèche, un 'sandwich' de transfert : à partir de l’électrode inférieure, placez (1) un tampon en fibre pré-trempé, (2) une membrane PVDF pré-trempée et rincée, (3) un gel, et (4) un deuxième tampon en fibre pré-trempé.
      REMARQUE : Pour éviter les bulles d’air dans le 'sandwich' de transfert, roulez doucement le 'sandwich' avec une pipette sérologique pour forcer les bulles à sortir. Une fois que le gel a été placé sur la membrane PDVF, ne le déplacez pas.
   6. Pour effectuer le transfert de protéines, réglez le bloc d’alimentation à 150 mA pendant 1 h (pour un 'sandwich').
3. Détection des modifications post-traductionnelles des histones (PTM) avec des anticorps spécifiques à la modification
   1. Retirez la membrane de l’appareil de transfert. Rincer brièvement avec du dH₂O.
      1. Facultativement, vérifiez le transfert des protéines avec le colorant Ponceau-S en versant suffisamment de colorant Ponceau-S pour couvrir la membrane dans une petite boîte en plastique et en incubant à RT en secouant doucement pendant 30−60 s. Retirez le colorant Ponceau-S et rincez avec du dH₂O jusqu’à ce que la tache de fond disparaisse et que les bandes de protéines soient visibles à l’œil nu. Continuez à rincer avec du dH₂O jusqu’à ce que toute la tache soit éliminée de la membrane.
   2. Bloquez la membrane en incubant la tache pendant 1 h à RT avec un léger balancement dans un tampon de blocage salin tris tamponné (TBS) (Table des matériaux) dans une petite boîte de coloration. Utilisez suffisamment de tampon de blocage pour couvrir la tache.
      REMARQUE : Veillez à placer la membrane à la verticale dans la boîte de coloration de sorte que le côté de la membrane sur lequel reposent les protéines ne soit pas orienté vers le bas.
   3. Incuber le transfert dans la boîte de coloration pendant la nuit avec un anticorps spécifique à la modification des histones réactif à la levure à 4 °C. Diluer l’anticorps dans le tampon bloquant le TBS selon les spécifications du fabricant. Incluez également un contrôle approprié de la charge nucléaire, comme un H3 anti-total élevé chez une espèce hôte différente de l’anticorps spécifique de la modification. Par exemple, si vous sondez H3S10ph avec un anticorps anti-H3S10ph élevé chez le lapin, utilisez un anticorps anti-H3 total élevé chez la souris comme contrôle de la charge. Répétez cette opération pour chaque tache si nécessaire.
      REMARQUE : Les dilutions d’anticorps peuvent être réutilisées pour un total de trois fois en un mois. Conservez-les à 4 °C.
   4. Lavez la membrane 4x avec du TBS maison + 0,1 % de polysorbate 20 (TBST) pendant 5 min avec balancement à RT.
   5. Incuber le transfert avec des anticorps secondaires fluorescents à des dilutions spécifiées par le fabricant (âne anti-lapin 680 et âne anti-souris) pendant 1 h à RT.
      REMARQUE : Les anticorps secondaires fluorescents doivent être protégés de la lumière pendant le stockage et l’utilisation. Effectuez l’incubation dans des boîtes en plastique foncé ou couvrez avec du papier d’aluminium.
   6. Lavez la membrane 4x avec TBST pendant 5 min et lavez-la avec TBS pendant 5 min tout en vous balançant à RT.
   7. Visualisez le transfert sur un système d’imagerie fluorescent Western Blot pendant 2 min. Visualisez les anticorps secondaires anti-lapin 680 et anti-souris 800 dans les canaux 800 nm et 700 nm, respectivement.
      REMARQUE : Les répétitions sont effectuées indépendamment à partir de la section 1. Pour une interprétation appropriée des données dans ces expériences, il est nécessaire de vérifier que la réponse au signal de l’anticorps se situe dans la plage sur laquelle la réponse au signal est linéaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x Running Buffer			Mélanger : 141,65 g de glycine (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g de base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g de dodécylsulfate de sodium (Sigma-Aldrich L3771) et 1 L d’eau déminéralisée, pH 8,8.
12 % Gels de polyacrylamide	BIO-RAD	456-1041	<
Sigma-Aldrich	M3148
Anti-acétyl-histone H3 (Lys14) Primaire Antibody	MilliporeSigma	07-353 (Lot n° 2762291)	Dilution : 1/1000
Anti-acétyl-histone H4 (Lys16) Anticorps primaire	Abcam	ab109463 (Lot No. GR187780)	Dilution : 1/2000
Anti-acétyl-histone H4 (Lys12) Anticorps primaire	Abcam	ab46983 (N° de lot. GR71882)	Dilution : 1/5000
Anti-diméthyl-histone H3 (Lys36) Anticorps primaire	Abcam	ab9049 (N° de lot. GR266894, GR3236147)	Dilution : 1/1000
Anticorps anti-histone H3 primaire	Abcam	ab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)	Contrôle de la charge nucléaire ; Dilution : 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Anticorps primaire	Abcam	ab188292 (N° de lot. GR211874)	Dilution : 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Anticorps primaire	Abcam	ab5176 (N° de lot. GR264582, GR192662, GR3217296)	Dilution : 1/1000
BioPhotometer D30	Eppendorf	6133000010
Centrifugeuse 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Lot n° C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Dilution : 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Lot n° C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Dilution : 1/2500
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Papier tache extra épais (papier filtre)	BIO-RAD	1703968
Membranes de transfert Immobilon-FL	MilliporeSigma	IPFL00010
Chargement de la teinture		<
Methanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	BIO-RAD	1658004
Pipette multicanaux	Eppendorf	2231300045
Eau sans nucléase	Qiagen	129114
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biosciences	2800-03
pAG303GAL-a-synuclein-GFP	Cadeau de A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	Cadeau de A. Gitler
Poly(éthylène glycol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	Préparez une solution à 50 % p/v.
Ponceau S Stain	Sigma-Aldrich	P3504	Mélange : 0,5 g 0,1 % p/p colorant Ponceau S, 5 mL d’acide acétique 1 % v/v (Sigma-Aldrich 320099) et 500 mL d’eau déminéralisée.
Bloc d’alimentation de base PowerPac	BIO-RAD	164-5050
Tampon de chargement de dodécylsulfate de sodium			Conserver à -20 oC. 6X, Mélange : 1,2 g de dodécylsulfate de sodium, 6 mg de bleu de bromophénol, 0,93 g de DL-Dithiothréitol, 2,1 ml d’eau déminéralisée, 4,7 ml de glycérol et 1,2 ml de base Trizma 0,5 M, pH 6,8.
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	221465	Préparez une solution de 0,2 M.
TBS + 0.1 % Tween 20 (TBST)			Mix : 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) et 900 mL d’eau déminéralisée.
Tampon bloquant TBS	LI-COR	927-5000
Cellule de transfert électrophorétique semi-sèche Trans-Blot SD	BIO-RAD	170-3940
Transfert Buffer			Mélange : 22,5 g de glycine, 4,84 g de base Tizma, 400 ml de méthanol, 1 g de dodécylsulfate de sodium et 1,6 L d’eau déminéralisée.
Saline tamponnée Tris (TBS)	<	10X, pH 7.6, Solution : Mélanger 24 g de base Trizma et 88 g de chlorure de sodium (Sigma-Aldrich S7653). Remplissez à 1 L d’eau déminéralisée.
WT 303 S. cerevisiae yeast	Cadeau de J. Shorter

td style='hauteur :15.5pt ;largeur :135pt ;'>2-mercaptoethanoltd style='largeur :314pt ;'>Mélange : 1,2 g de dodécylsulfate de sodium, 6 mg de bleu de bromophénol (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL de glycérol, 1,2 mL de base de trizma 0,5M pH 6,8, 0,93 g de DL-Dithiothréitol ( Sigma-Aldrich D0632) et 2,1 mL d’eau désionisée.td style='largeur :108pt ;'>