Génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel d’invasion de cellules tumorales

Résumé

Source : Guyon, J., et al. Un modèle sphéroïde 3D pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2020)

La vidéo démontre la génération d’un modèle sphéroïde tridimensionnel de l’invasion des cellules tumorales. Les sphéroïdes sont formés à partir de cellules tumorales du cerveau humain et intégrés dans une matrice de collagène. Les cellules tumorales à la périphérie des sphéroïdes adoptent un phénotype invasif, sécrétant des protéases pour dégrader le collagène et progressant pour envahir la matrice environnante.

Protocole

1. Génération de sphéroïdes tumoraux de taille uniforme

REMARQUE : Les cellules souches sont cultivées dans un milieu neurobasal complété par un supplément de B27, de l’héparine, du facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2), de la pénicilline et de la streptomycine. Ces cellules forment spontanément des sphéroïdes en culture.

1. Laver les cellules tumorales avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incuber les cellules avec 0,5 à 1 mL d’enzyme de dissociation pendant 5 minutes à 37 °C.
2. Laver avec 4-4,5 mL de PBS et ajouter 10 mL du milieu de croissance complet (milieu neurobasal complet, cNBM).
3. Comptez les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique avec du bleu trypan et une lame de chambre de comptage de cellules.
4. Pour générer 100 sphéroïdes avec 10⁴ cellules par sphéroïde (selon la taille préférée), mélangez 10⁶ cellules dans 8 mL de NBM avec 2 mL de méthylcellulose à 2 %.
5. Transférez la suspension dans un récipient stérile et distribuez 100 μL/puits avec une pipette multicanaux dans une plaque inférieure ronde à 96 puits.
6. Incuber la plaque à 37 °C, 5 % CO₂ et 95 % d’humidité. Des sphéroïdes de taille égale se formeront et pourront être utilisés après 3-4 jours.

2. Expériences tridimensionnelles

1. Invasion
   1. Préparation
      1. Préparer la matrice de collagène dans un tube sur glace avec du collagène de type I à une concentration finale de 1 mg/mL, 1x PBS, 0,023xV_collagène, 1 M d’hydroxyde de sodium et H₂O. Incuber la solution sur de la glace pendant 30 min.
      2. Recueillir les sphéroïdes de la plaque à fond rond dans des tubes de 500 μL et laver 2x avec 200 μL 1x PBS.
      3. Pipetez soigneusement les sphéroïdes dans 100 μL de la matrice de collagène et insérez-les au centre d’un puits dans des plaques normales à 96 puits.
      4. Incuber le gel de collagène pendant 30 minutes à 37 °C, puis ajouter du cNBM sur le gel. Des inhibiteurs ou des activateurs (par exemple, du chlorure d’hydrogène comme indiqué dans Figure 1B, 1C) peuvent être ajoutés au milieu à cette étape.
   2. Acquisition et analyse d’images
      1. Prenez des photos séquentiellement avec un microscope vidéo en mode fond clair 24 h après l’inclusion du collagène.
      2. Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatisée. Pour ce faire manuellement, dessinez autour du noyau et de l’aire totale du sphéroïde à l’aide de l’outil de sélection à main levée et mesurez l’aire invasive de chaque sphéroïde en soustrayant l’aire totale de l’aire centrale. Pour analyser les images de manière semi-automatisée, utilisez une macro pour déterminer la zone invasive.

Résultats

Figure 1 : Sphéroïde P3 du glioblastome dans les essais de prolifération, d’invasion ou de migration. (A) Essai de prolifération. Panneau de gauche : Images représentatives avec du DMSO comme contrôle ou avec 20 μM de roténone (inhibiteur de la chaîne respiratoire complexe I) à l’instant 0 ou 72 h. Panneau de droite : Quantification de l’aire du sphéroïde ...

Matériaux