Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Extraction de la α-synucléine (αS) à partir de régions cérébrales disséquées
- Disséquez un cerveau entier dans une boîte de Pétri en plastique de 35 mm sur de la glace avec une loupe de faible puissance (grossissement 8X) à l’aide de deux forcipes dont les extrémités sont maintenues ensemble, sauf lors de la dissection de l’hippocampe. Ne pas dépasser 10 min pour préserver l’intégrité du cerveau. Placez le cerveau à l’endroit et récupérez les régions cérébrales suivantes dans cet ordre :
- Séparez l’un des deux bulbes olfactifs à l’aide d’une pince placée juste derrière lui. Détachez-le du cerveau en le déplaçant vers le bas. Répétez cette opération pour la deuxième ampoule.
- Calez doucement la pince entre les deux cortex et déplacez-la vers l’avant pour faciliter la dissociation des deux cortex. En maintenant le cerveau en place avec une pince, utilisez une autre pour séparer le cortex de l’hippocampe.
- Positionnez la pince à 2 mm sous le cortex. Maintenez une légère pression sur la pince jusqu’à ce que le haut de l’hippocampe soit visible. Décollez la première partie du cortex et répétez avec la deuxième partie. Utilisez la pince pour séparer les deux cortex en commençant par l’hippocampe et en se déplaçant vers l’avant du cerveau.
- Positionnez la pince ouverte autour de l’un des hippocampes. Fermez la pince au bas de l’hippocampe puis retirez-la délicatement en récupérant autant que possible. Répétez la procédure pour le deuxième hippocampe.
- Placez la pince ouverte sous l’une des stries et séparez-la doucement du cerveau. Utilisez la pince pour retirer tout cortex restant du striatum. Répétez cette procédure pour le deuxième striatum.
- Utilisez la pince pour enfoncer doucement le contour du cervelet de 2 mm afin de faciliter sa séparation du cerveau. Placez la pince juste derrière le cervelet et retirez-les en déplaçant la pince vers l’avant.
- Utilisez la partie large de la pince pour soulever le mésencéphale afin de voir clairement où il rejoint le tronc cérébral. Faites une incision verticale à la jonction puis retirez le tronc cérébral.
- Positionnez la pince derrière le mésencéphale, qui est composé de quatre structures arrondies. Incisez verticalement jusqu’à ce que le mésencéphale ait été complètement séparé du cerveau restant.
- Préparez des homogénats de pourcentage variable (poids/volume) dans un tampon à haute teneur en sel (HS), en fonction du nombre de tissus disponibles : 5 % d’homogénat pour un poids compris entre 10 et 30 mg, 10 % pour un poids compris entre 30 et 80 mg et 20 % pour un poids supérieur à 80 mg.
- Ajouter un volume adéquat de tampon HS aux régions cérébrales disséquées pour obtenir le pourcentage attendu d’homogénat.
- Vortex et vérifiez que les tissus sont bien immergés dans le tampon HS.
- Homogénéiser les échantillons préparés à partir des régions cérébrales disséquées ou de la moelle épinière cervicale à l’aide d’un broyeur de tissus composé d’un tube en verre borosilicaté et de deux pilons, A et B.
- Versez chaque région du cerveau à écraser directement dans le tube. Insérez le pilon A dans le tube et rétractez-le. Répétez ce mouvement une dizaine de fois pour dissocier le tissu. Ensuite, utilisez le pilon B pour continuer à broyer le tissu avec 20 mouvements supplémentaires. Transférez les homogénats dans un tube de 1,5 ml à l’aide d’une pipette de transfert de 1 ml.
- Centrifugez les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer tout fragment de cerveau non broyé. Récupérez les surnageants, divisez-les en aliquotes de 200 μl et conservez-les à -80 °C pour une analyse ultérieure.
1. Détection de αS par ELISA
- Diluer les anticorps d’enrobage à 0,01 ng/ml. Utiliser un anticorps polyclonal ou monoclonal de lapin anti-αS 42 dans un tampon Na2CO3/NaHCO3 (pH 9,6).
- Enduire les microplaques à 96 puits avec 100 μl par puits de cette solution d’enrobage, et laisser à 4 °C O/N. Utilisez l’anticorps polyclonal de lapin anti-αS dans la solution d’enrobage pour les ELISA à l’aide des anticorps de détection syn514, clone 42, LB509, AS11, 4D6 ou 8A5. Utilisez l’anticorps monoclonal anti-αS clone 42 comme solution d’enrobage en combinaison avec l’anticorps de détection αS anti-pSer129.
NOTE : Si nécessaire, les plaques peuvent être maintenues à 4 °C pendant une semaine avant que l’ELISA ne soit effectué. - À l’aide d’un laveur de plaques, laver les plaques cinq fois avec 300 μl de solution saline tamponnée au phosphate avec 0,05 % de Tween 20 (PBST) par puits. À partir de cette étape, l’incubation se fait à RT.
- Ajouter 200 μl de tampon de blocage T20 PBS (solution saline tamponnée au phosphate) par puits. Agiter pendant 1 h à 150 tr/min. Lavez les assiettes cinq fois avec PBST.
- Diluer les homogénats cérébraux (dilution 1:100 des homogénats à 20 %, 1:50 des homogénats à 10 % et 1:25 des homogénats à 5 % dans les PBST BSA 1 %), et ajouter 100 μl dans chaque puits. Incuber ensuite pendant 2 heures en secouant à 150 tr/min. Lavez les assiettes cinq fois avec PBST.
- Ajouter les différents anticorps de détection αS dans le PBST avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % aux dilutions mentionnées dans la liste des matériaux. Incuber pendant 1 h à 150 tr/min. Lavez les assiettes cinq fois avec PBST.
- Ajouter des conjugués IgG HRP anti-souris ou anti-lapin dilués 1:8 000 dans du PBST complété par BSA 1 % pendant 1 heure tout en agitant à 150 tr/min. Lavez les assiettes cinq fois avec PBST.
- Ajouter 100 μl de solution de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) dans chaque puits et incuber pendant 15 minutes dans l’obscurité en agitant à 150 tr/min.
- Stopper la réaction en ajoutant 100 μl de HCl 1 N par puits puis mesurer l’absorbance à 450 nm avec le lecteur de microplaques.
- Pour l’analyse des données, soustrayez la valeur de DO obtenue dans un puits avec tous les réactifs à l’exception des échantillons de cerveau de souris (puits à blanc) des valeurs de DO mesurées pour chacun des échantillons analysés.