Modélisation des métastases tumorales cérébrales par injection interne de cellules cancéreuses dans l’artère carotide

Résumé

Source : Lim, M., et al. Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne. J. Vis. Exp. (2022)

Dans cette vidéo, une souris anesthésiée subit une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules cancéreuses sont injectées dans l’artère carotide commune (ACC) pour faciliter l’administration ciblée au cerveau. La procédure implique une suture précise et une manipulation des artères carotides pour diriger les cellules injectées vers l’artère carotide interne (ICA), favorisant ainsi la formation de tumeurs dans le cerveau au fil du temps.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

{TAG_11}}1. Préparation de cellules cancéreuses pour injection

REMARQUE : Dans cette étude, la lignée cellulaire du cancer du sein humain, BT-474 (BT474), a été utilisée. Le BT474 a été cultivé dans un milieu de croissance complet composé d’un milieu RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium) 1640 complété par 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % d’insuline. Les cellules ont été maintenues dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone dans l’atmosphère de l’air. Authentifiez la lignée cellulaire par des tests répétés en tandem satellite, confirmez l’expression de la protéine rapporteure (par exemple, la luciférase), le cas échéant, et vérifiez l’infection à mycoplasmes.

1. Ensemencer les cellules cancéreuses BT474 à une densité d’ensemencement de 2,0 × 10^6 cellules dans une fiole T75 à l’aide de 10 mL de milieu de croissance complet et cultiver (à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone) jusqu’à une confluence de 70 % à 80 % avant l’injection.
2. Le jour de l’injection, jetez le milieu de croissance et lavez la monocouche cellulaire deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Ajouter 5 mL de réactif de dissociation de culture cellulaire préchauffé et incuber à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient détachées. Après 5 min, tapotez doucement le ballon pour faciliter le détachement des cellules.
4. Ajouter 5 ml de milieu de croissance complet contenant 10 % de sérum de bovin fœtal pour éteindre l’activité du réactif de dissociation.
5. Remettez doucement les cellules en suspension par pipetage pour réduire les amas cellulaires.
6. Transvasez la suspension cellulaire dans un tube de 50 mL et centrifugez-la à 180 x g pendant 3 min à température ambiante.
7. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) sans calcium ni magnésium pour minimiser l’agglutination des cellules.
8. Centrifuger la suspension cellulaire à température ambiante à 180 x g pendant 3 min.
9. Décanter le surnageant pour éliminer le sérum résiduel/réactif de dissociation et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3 mL de HBSS.
10. Placez une passoire cellulaire de 100 μm sur un tube conique frais de 50 ml et passez la suspension cellulaire pour éliminer les amas cellulaires.
    REMARQUE : Une suspension unicellulaire est essentielle pour minimiser l’occlusion des vaisseaux sanguins et le risque d’accident vasculaire cérébral lors de l’injection.
11. Calculer le nombre de cellules viables à l’aide de l’exclusion du Trypan Blue et d’un hémocytomètre à l’aide de méthodes standard.
12. Diluer la suspension cellulaire avec HBSS à une concentration cellulaire de 2,5 x 10⁶{TAG_122}} cellules/ml.
13. Gardez le tube à l’horizontale sur de la glace et secouez-le doucement périodiquement pour minimiser l’agglutination. La suspension cellulaire peut être stockée sur de la glace pendant un maximum de 6 h.
    REMARQUE : Le balancement était effectué manuellement, mais cela peut également être fait à l’aide d’un agitateur à bas régime.

2. Préparation de la souris pour la procédure

REMARQUE : Dans cette étude, des souris femelles NOD scid âgées de 4 à 5 semaines ont été utilisées. Introduisez des aliments de récupération à régime mou (par exemple, gel diététique, hydrogel, purée de souris chow) aux souris 3 jours avant l’intervention pour les encourager à s’alimenter après l’intervention.

1. Outils chirurgicaux en autoclave. Vaporisez et essuyez la zone chirurgicale et l’équipement avec un désinfectant de surface, suivi de 70 % d’éthanol.
2. Placez un tapis chauffant pour animaux sous la planche chirurgicale pour éviter l’hypothermie. Allumez-le 30 minutes avant l’opération. Vaporisez et essuyez la planche chirurgicale avec un désinfectant de surface, suivi de 70 % d’éthanol.
3. Préparez une cage propre pour le logement des animaux et un coussin chauffant chaud pour la récupération.
4. Mettez un équipement de protection individuelle propre (blouse, masque, filet à cheveux et gants). Maintenez la stérilité tout au long de la procédure à l’aide de gants d’examen propres et d’une technique d’instruments uniquement.
5. Anesthésie la souris à l’aide d’une chambre anesthésique à l’aide d’isoflurane à 5 % avec un débit d’oxygène de 2 L/min jusqu’à ce que la souris perde le réflexe de pédale.
6. Sortez l’animal de la chambre et placez-le dans un cône nasal délivrant de l’isoflurane à 2 % à un débit d’oxygène de 2 L/min pour le reste de l’intervention chirurgicale.
7. Souris à poinçon d’oreille pour l’identification et utilisez une tondeuse électrique pour raser la fourrure de la région du cou. Nettoyez l’excès de poils de la peau exposée à l’aide de ruban adhésif.
8. Pesez la souris pour calculer les doses d’anesthésique et d’analgésique requises. Administrer la buprénorphine et le méloxicam à raison de 50 μg/kg et 1 mg/kg, respectivement, par injection sous-cutanée.
9. Transférez la souris sur une planche chirurgicale chaude et fixez le cône nasal avec du ruban adhésif.
10. Appliquez du lubrifiant oculaire sur les yeux pour éviter le dessèchement.
11. Fixez doucement la souris en accrochant d’abord les incisives supérieures à l’aide d’un fil collé à la planche chirurgicale, puis en collant sur les pattes avant et arrière. Cette étape permet d’étendre le corps et de maintenir le cou droit pendant la procédure.
12. Effectuez la préparation préopératoire de la peau comme décrit ci-dessous.
    1. Essuyez le cou avec un antiseptique topique (povidone iodée) pour réduire la charge de la microflore cutanée et éliminer les poils morts. Nettoyez à partir du centre de la peau, en travaillant vers l’extérieur pour éviter une recontamination du site d’incision. Répétez le processus en utilisant de l’éthanol à 70 %. Effectuez trois cycles alternés d’iode et d’éthanol pour la désinfection.
    2. Posez un champ chirurgical sur l’animal. Celui-ci est découpé et façonné à partir d’un morceau d’essuie-tout stérile ou d’un sac autoclave.
13. Disposez des essuie-tout stériles ou des sacs d’autoclave pour les outils chirurgicaux.
14. Vérifiez la présence de réflexe via 'Test de pincement' pour assurer une anesthésie suffisante avant de poursuivre la procédure.

3. Injection carotidienne interne

REMARQUE : Dans cette expérience, une canule de perfusion de 31 G et un dispositif de seringue activé par le pied ont été utilisés pour faciliter la procédure d’injection. Cette configuration est facultative et l’utilisateur peut utiliser une seringue à insuline de 31 G et sauter les étapes 3.11 et 3.12. Pour préparer la canule de perfusion, tirez et séparez la partie de l’aiguille de la partie d’ajustement de la seringue d’une aiguille de 31 G à l’aide de deux paires de pinces de suture. Ensuite, fixez la partie de l’aiguille à l’une des extrémités d’un tube de perfusion fin d’environ 10 cm de long.

1. Placez le microscope de dissection sur la souris.
2. À l’aide de ciseaux, faites une incision verticale de 15 mm le long de la ligne médiane au niveau de la région du cou, à partir de 5 mm sous la mâchoire jusqu’à l’entrée thoracique.
3. À l’aide de deux paires de pinces coudées, écartez la peau et les glandes salivaires sous-jacentes et appliquez des écarteurs pour maintenir la trachée exposée. L’étape suivante exposera la gaine carotidienne qui se trouve parallèlement à la trachée.
4. À l’aide de deux paires de pinces à angle fin, disséquez brutalement le muscle et le tissu adipeux adjacents à la trachée pour exposer la gaine carotidienne droite. La gaine carotide est la couche fibreuse recouvrant l’artère carotide commune, la veine et le nerf vague, et ce faisceau peut être visualisé par l’artère carotide commune rouge vif. Dans cette étude, l’injection a été réalisée sur l’artère carotide droite.
5. Dégagez un segment de l’artère carotide caudale commune jusqu’à la bifurcation carotidienne du fascia environnant et séparez-le du nerf vague et des veines.
6. Isolez et dégagez la bifurcation carotidienne (la jonction qui relie les artères carotides externe et interne) des nerfs et du fascia environnants. Placez une pince fine sous l’artère carotide externe et passez une suture en soie (épaisseur 5-0) sous l’artère. Noeudez et serrez la suture et coupez la ligne en excès.
   REMARQUE : Cette ligature (L1) empêchera l’injecté de transiter par l’artère carotide externe.
7. Placez des pinces fines sous l’artère carotide commune et passez une suture en soie (épaisseur 5-0) sous l’artère. Faites un nœud et serrez la suture à une position proximale du site d’injection proposé. Coupez l’excédent de suture en laissant environ 10 mm de ligne.
   REMARQUE : Cette deuxième ligature (L2) limitera le flux sanguin et les saignements après l’injection. Il est également utilisé pour positionner et maintenir l’artère carotide pendant l’injection.
8. Coupez et humidifiez une bande d’essuie-glaces jetables (autoclavés) à faible peluche d’environ 10 mm x 5 mm. Pliez la bande en 4 mm x 5 mm, d’une épaisseur de 2 à 3 mm, et placez-la sous l’artère carotide au site d’injection proposé. Cela soutiendra le vaisseau pendant l’injection.
9. Sur l’artère carotide rostrale commune au site d’injection proposé, placez une troisième ligature (L3) avec un nœud lâche. Celui-ci n’est serré qu’après l’injection (à l’étape 3.16).
10. Agitez doucement la suspension cellulaire et aspirez 200 μL de suspension cellulaire dans une seringue à insuline (avec une aiguille de 31 G).
11. Chargez la seringue dans le tourne-seringue, qui est relié à une pédale d’activation.
12. Fixez une canule fine avec une aiguille de 31 G à la seringue et amorcez la ligne.
13. Vérifiez si l’artère carotide est bien positionnée et pressurisée.
14. À l’aide de deux pinces à angle fin, l’une tendant doucement sur l’extrémité de la première ligature et l’autre tenant l’aiguille 31 G, insérez lentement l’aiguille avec biseau vers le haut dans la lumière du vaisseau sanguin en prenant soin de ne pas la perforer.
15. Injectez lentement 100 μL de suspension cellulaire (à partir de l’étape 1.13) dans l’artère carotide commune à 10 μL/s. Cela permettra de délivrer 2,5 × 10^5 cellules dans le vaisseau sanguin. L’injection réussie est visualisée via{TAG_397}} l’élimination du sang du vaisseau sanguin carotide.
16. Soulevez et resserrez doucement la ligature lâche (L3) (à partir de l’étape 3.9) immédiatement après avoir retiré l’aiguille pour éviter le reflux et le saignement. Coupez l’excédent de suture.
    REMARQUE : Il est normal d’observer une petite quantité de sang gicler après le retrait de l’aiguille. Cependant, il ne doit pas y avoir de saignement actif après le resserrement de la troisième ligature.
17. Retirez le morceau d’essuie-glaces jetables peu pelucheux humidifiés.
18. À l’aide d’une pipette P200, rincez deux fois la cavité chirurgicale avec 150 à 200 μL d’eau stérile ou de solution saline.
19. Vérifiez à nouveau qu’il n’y a pas de purge, puis retirez les écarteurs.
20. Repositionnez les tissus mous, les glandes salivaires et la peau sur l’artère carotide et la trachée.
21. Fermez la couche cutanée de l’incision à l’aide d’un porte-aiguille de suture, d’une pince et d’une suture monofilament 6/0 résorbable ou non résorbable selon un motif continu.
22. Jetez la seringue à aiguille de la canule et préparez une nouvelle configuration pour la souris suivante. L’utilisation d’une nouvelle seringue garantira que le nombre de cellules injectées dans chaque souris est constant.
    REMARQUE : Des instantanés représentatifs de la procédure sont en Si le vaisseau est perforé ou déchiré par l’aiguille, indiqué par une fuite d’injectat ou un saignement, la procédure est considérée comme infructueuse. Ensuite, l’aiguille doit être retirée et la troisième ligature doit être immédiatement serrée pour éviter d’autres saignements. Si le saignement persiste après le resserrement de la suture, l’animal doit être euthanasié avec du pentobarbital.

4. Récupération post-injection

1. {TAG_473}}Injecter de la buprénorphine (50 μg/kg) et du méloxicam (1 mg/kg) via injection sous-cutanée pour soulager la douleur post-chirurgicale.
2. Déplacez l’animal dans une cage chaude et propre pour qu’il se remette de l’anesthésie. Il est normal qu’un animal ait une activité modérée (recroquevillé et inactif ou se déplaçant lentement) après son réveil.
3. Après 30 à 45 minutes, transférez les souris dans une installation de détention à long terme.
4. Donnez aux souris un régime doux (gel diététique, hydrogel, purée) pendant au moins une semaine après la chirurgie et vérifiez quotidiennement l’état physique avec une attention particulière pour les signes d’accident vasculaire cérébral, d’infection et de saignement autour du site de la plaie.
5. Deux jours après l’opération, il est typique que l’animal ait une activité réduite, une fourrure légèrement ébouriffée et une perte de 15 % de son poids corporel préopératoire. Administrer un analgésique (méloxicam) quotidiennement pendant 2 à 3 jours après la chirurgie pour gérer la douleur et aider à la récupération.
6. À partir du 3e jour, les animaux doivent avoir retrouvé de l’activité, augmenté la fréquence des repas et du toilettage et repris du poids. Euthanasier les animaux présentant des déficits persistants en condition physique (douleur, recroquevillement, inactivité, perte de poids) après 4 jours post-opératoire en injectant du pentobarbital sodique à 200 mg/kg via injection intrapéritonéale.
7. La greffe et la progression tumorale peuvent être surveillées à l’aide de l’anesthésie et de la modalité d’imagerie de votre choix, telle que l’imagerie bioluminescente, l’IRM ou la TEP/IRM. La nécessité et la capacité d’entreprendre une telle imagerie dépendront intrinsèquement des objectifs du projet individuel et de l’installation dans laquelle elle est entreprise, ainsi que du type d’étiquette rapporteure, des lignées cellulaires utilisées, de l’accessibilité des installations de radiochimie et d’imagerie nucléaire pertinentes.
   REMARQUE : Certains animaux peuvent ne pas bien réagir et subir un AVC malgré une procédure réussie. Après l’intervention, les animaux qui présentent des symptômes de détresse neurologique (tourner la tête et tirer d’un côté, comportement circulaire, rouler, se débattre, perte de la fonction motrice) doivent être euthanasiés immédiatement.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique du protocole d’injection de l’artère carotide interne pour les métastases cérébrales. L’injection de l’artère carotide interne avec la ligature de l’artère carotide externe peut produire de manière fiable un modèle de métastases cérébrales à partir de divers cancers primitifs. Dans ce protocole, trois ligat...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
30G Microlance needle	BD	23748
31G Ultra-Fine II insulin seringue	BD	326103
Pince coudée	Proscitech	T67A-SS	Pointe fine, coudée sans dentelures, pointe de 18mm, longueur 128 mm
Tapis
Antibiotique et antimycosique	ThermoFisher Scientific	15240062
BT-474 (HTB-20) lignée cellulaire du cancer du sein	ATCC	HTB-20
Buprénorphine (TEMGESIC)
compteur de cellules Countess	ThermoFisher Scientific	C10227
Microscope
Oreille perforateur
Tondeuses
Pince coudée fine	Proscitech	DEF11063-07	Inclinée 45°, Pointe lisse, Largeur de la pointe : 0.4 mm, Dimension de la pointe : 0.4 x 0.3 mm, longueur 9cm
Tube fin pour canule, Tube OD (in) 1/32, ID du tube (in) 1/100in	Cole Parmer	EW-06419-00
Sérum fœtal bovin	ThermoFisher Scientific	26140079
La solution saline équilibrée de Hank sans calcium ni magnésium	ThermoFisher Scientific	14170120
Isoflurane
Essuie-glaces jetables Kimwipes Low lint	Kimberly Clark- Kimwipes	Z188964
Purée de souris chow
Meloxicam (METACAM)
Cône			de nezFabriqué à partir d’un tube
Lubrifiant oculaire PAA (Carbomer 2mg/g)	Bausch and lomb
Solution de povidone iodée	Betadine	2505692
EPI (gant, masque, blouse, filet à cheveux)
Retractors	Kent Scientific	SURGI-5001
RPMI 1640 Media	ThermoFisher Scientific	11875093
Suture en soie 13mm 5-0, P3, 45cm	Ethicon	JJ-640G
Saline normale stérile	ThermoFisher Scientific	TM4469
Ruban adhésif
Planche			Une planche à découper enveloppée d’un sac autoclave.
Ciseaux chirurgicaux	Proscitech	T104	Dimensions de l’embout (LxP) : 38x7mm, Longueur 115mm
Pince à suture/ Pince Brophy incurvée	Proscitech	T113C	Courbée, Pointe étroite arrondie de 2 mm, avec dentelures, longueur 165 mm
Porte-aiguille de suture (porte-aiguille Olsen Hegar)	Proscitech	TC1322-180	longueur 190 mm, pince à cliquet
Pousse-seringue avec pédale/ UMP3 Ultra micro pump	World Precision Instruments	UMP3-3
T75 Flacon de culture tissulaire	ThermoFisher Scientific	156499
Thread
Trigene II désinfectant de surface	Ceva

chauffant pour animaux de dissectionélectriques microfuge chirurgicale