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1. Génération de sphéroïdes tumoraux de taille reproductible
- Collecte des neurosphères mutantes de la ligne médiane diffuse (DMG) H3K27M (NS) et centrifuge-t-elle à 170 x g pendant 10 minutes (min) à température ambiante (RT).
- Pour briser le NS, incuber 500 μL de la solution d’accutase pendant 3 min à 37 °C.
- Neutralisez la solution d’accutase avec des cellules souches tumorales (TSM) medium7 et centrifugez le suspension de cellule à 355 x g pendant 5 min à RT.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu TSM, puis maintenir les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules.
- Diluez la suspension de cellule pour obtenir 2,5-5 x 103 cellules/mL et grainez 100 μL/puits dans des plaques à fond rond à 96 puits à fixation ultra-faible (ULA) (voir Table of Materials). Utiliser une densité cellulaire appropriée pour obtenir un NS individuel de ~300 μm de diamètre, 4 jours après l’ensemencement cellulaire (250-500 cellules/puits pour les cellules de gliome très agressives).
- Confirmer visuellement la formation de NS à l’aide d’un microscope inversé 4 jours après l’ensemencement cellulaire.
2. Préparation du complexe réactif de marquage d’anticorps (ALR)/anticorps et configuration pour le test de migration
- Considérez le nombre de puits à analyser et calculez le volume nécessaire pour chaque réactif. Incluez également les puits nécessaires pour les contrôles négatifs. Vérifiez visuellement le NS à l’aide d’un microscope inversé avant de commencer.
- Utilisez des plaques à fond plat à 96 puits. Effectuez le revêtement. Pour cette étude, la matrice de membrane basale (BMM) est utilisée comme revêtement mince.
- Une fois que l’enrobage est prêt, retirez l’excédent de revêtement BMM avec une pointe p200, en plaçant la pointe sur le bord du puits et en évitant de toucher le fond. Si vous travaillez avec plusieurs puits, utilisez une pipette multicanaux.
- Coupez une pointe p200, prélevez 50 μL de milieu cellulaire + NS de chaque puits sélectionné et transférez-le dans un puits à fond plat enrobé. Vérifiez visuellement la présence et la position du NS dans chaque puits.
REMARQUE : Chaque NS doit être situé au centre du puits. Évitez de vous appuyer sur la pointe sur le bord du puits pendant le transfert mais déposez le milieu au centre du puits sans toucher le fond. Pour les cellules hautement migratrices, considérez un nombre plus élevé de répétitions que les trois répétitions standard. En effet, lorsque le NS se trouve trop près du bord du puits, les cellules en migration peuvent couvrir une plus petite surface du puits. - Ajouter 100 μL d’eau stérile à l’ALR pour réhydrater le réactif (concentration finale = 0,5 mg/mL). Pipette pour mélanger la solution. REMARQUE : Le réactif est sensible à la lumière ; Par conséquent, restez dans l’obscurité. Aliquote le réactif restant et conservez-le à -80 °C (évitez de geler et de décongeler).
- Mélangez l’anticorps avec l’ALR dans le milieu de croissance cellulaire complet approprié dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et à l’abri de la lumière. Préparez une quantité suffisante pour distribuer 50 μL/puits à 3 fois la concentration finale du dosage. Incuber à RT pendant 15 min.
- Diluer le réactif suppresseur de bruit de fond (BSR) dans un milieu TSM (ou un milieu de croissance cellulaire approprié pour la lignée cellulaire de votre choix) à 1,5 mM (3x) pour obtenir à la fin du test une concentration finale de 0,5 mM.
< style de span='famille-de-police :Roboto,sans-serif ;taille-de-police :12pt ;style-de-police :normal ;variante-de-police :normal ;décoration-de-texte :aucun ;align-vertical :baseline ;espace-blanc :pré-enveloppement ;'>NOTE : réactif est sensible à la lumière. Voir ci-dessus pour les bonnes procédures de manipulation. - Ajouter délicatement 50 μL de BSR dans chaque puits.
- Ajoutez doucement 50 μL de l’ALR/anticorps dans chaque puits. Attendez 2 ou 3 minutes pour laisser les réactifs se mélanger et vérifiez visuellement à l’aide d’un microscope inversé pour vous assurer que la plupart des NS répliqués sont situés au centre du puits.
- Évitez la formation de bulles et éliminez celles existantes à l’aide d’une aiguille. Transférez doucement la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes placé dans l’incubateur à 37 °C, 5 % CO2, 95 % d’humidité.
3. Réglage de l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’acquisition d’images
- Scannez les plaques à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes (pour les spécifications, voir Table de Materials) avec des intervalles de balayage commençant à partir du point zéro (t0) des tests d’invasion et de migration mis en place, respectivement, après l’étape 2.14. et 3.10. jusqu’à 96 h.
< style de span='famille-de-police :Roboto,sans-serif ;taille-de-police :12pt ;style-de-police :normal ;variante-de-police :normal ;décoration-de-texte :aucun ;align-vertical :baseline ;espace-blanc :pré-enveloppement ;'>NOTE : S’assurer de pouvoir se débarrasser de l’instrument d’analyse de cellules vivantes immédiatement après le début de l’essai d’invasion et de migration. Selon le type de tumeur, les cellules peuvent commencer à envahir ou à migrer du NS déjà dans l’heure suivant la configuration du test. - Sur le logiciel de l’instrument d’analyse de cellules vivantes, sélectionnez l’option Schedule to Acquire. Cliquez sur le + tab et sélectionnez l’option Scan on Schedule.
- Sur la fenêtre du logiciel Create or Restore Vessel, cliquez sur l’option New.
- Sélectionnez l’application spécifique dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes pour l’acquisition de l’invasion et de la migration. Sélectionnez Spheroid scan type, objectif 4x, Phase+Brightfield et Green canaux d’image pour le test d’invasion. Sélectionnez Dilution Cloning scan type, objectif 4x et Phase et Green pour le test de migration.
- Sélectionnez le type de plaque et définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques.
- Configurez la fréquence d’analyse (pour les expériences de ce protocole, la fréquence d’analyse était de 15 minutes pour l’invasion et de 30 minutes pour la migration).
- Cliquez sur Ajouter au calendrier et lancez le scan.