Caractérisation des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle à l’aide de l’immunofluorescence

Résumé

Source : Ear, P. H., et. al. Etablissement et caractérisation des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle. Les sphéroïdes sont fixés, perméabilisés et bloqués, puis sont incubés avec des anticorps primaires et secondaires. Un colorant est ajouté pour colorer les noyaux avant de les monter et de les visualiser au microscope fluorescent.

Protocole

1. Collection de tumeurs neuroendocrines de l’intestin grêle (SBNET) et dissociation

1. cellulaireObtenir des échantillons SBNET de patients réséqués après confirmation du tissu tumoral de la carotte de pathologie chirurgicale.
2. Coupez les SBNET en cubes de 5 mm et rangez-les dans 25 mL de médium Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 de Dulbecco dans un tube conique pour le transport au laboratoire.
3. Transférez les tumeurs dans du DMEM contenant 1 % de sérum bovin fœtal ou FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Streptomycine) et 1 % de glutamine (Wash Medium), et incubez dans ce Wash Medium pendant 15 min.
4. Transférez les tumeurs dans un nouveau plat et coupez-les en morceaux de moins de 1 mm de diamètre à l’aide de ciseaux incurvés stériles.
5. Transférez les mouchoirs hachés dans un nouveau tube de 50 mL contenant 25 mL de produit de lavage.
6. Centrifuger l’échantillon à 500 x g pendant 15 min à 4 °C.
7. Jetez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 10 mL de Wash Medium contenant de la collagénase (100 U/mL) et de la DNase (0,1 mg/mL).
8. Laisser les tumeurs hachées être digérées dans un incubateur à 37 °C avec agitation lente (50 tr/min) pendant 1,5 h.

2. Culture de SBNET en tant que sphéroïdes tumoraux dans une matrice extracellulaire (ECM)

1. Une fois la digestion terminée (étape 1.8), centrifuger à 500 x g pendant 15 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 15 mL de milieu de lavage.
2. Placez une crépine de 70 μm sur un nouveau tube de 50 mL et transférez 10 mL du produit de lavage sur la crépine de cellule. Faites tourner le produit de lavage pour couvrir le côté du tube en plastique afin d’éviter que les cellules NET ne collent sur le côté du tube en plastique.
3. Filtre la suspension de cellule à travers une crépine de cellule.
4. Centrifugez à 500 x g pendant 15 min à 4 °C, jetez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 200 μL de produit de lavage (le volume total est de ~ 250 μL), et placez-la sur de la glace.
5. Transfère 5 μL de cellules à 500 μL de milieu de lavage (facteur de dilution de 1/100). Utilisez les cellules diluées pour le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre afin d’obtenir le nombre de cellules par millilitre. Multipliez par 100 pour corriger le facteur de dilution.
6. Multipliez le nombre de cellules par mL obtenu à l’étape 2.5 par le volume total de cellules en suspension obtenu à l’étape 2.4 (~ 250 μL).
7. Centrifugez à 500 x g pendant 15 min à 4 °C, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans une ECM liquide (1 x 10⁶ cellules/mL), et conservez sur de la glace.
8. Transférez 5-20 μL de sphéroïdes SBNET en ECM sur une plaque à 96 puits et laissez l’ECM liquide se solidifier en plaçant la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 5 min.
9. Ajouter 200 μL de milieu de culture SBNET (DMEM/F12 + 10 % FBS + 1 % PEN/STREP + 1 % Glutamine + 10 mM de nicotinamide + 10 μg/mL d’insuline) à chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les sphéroïdes SBNET en ECM.
10. Alternativement, cultivez des organoïdes SBNET dans des milieux de cellules souches similaires à ce qui a été décrit précédemment pour la croissance d’organoïdes hépatiques ou pancréatiques humains et répertorié dans la Table des matériaux.
11. Changez de média tous les 5-7 jours.

3. Caractérisation des sphéroïdes SBNETS par immunofluorescence

1. Transférez les organoïdes cultivés en ECM dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette P1000.
2. Centrifugez à 1 500 x g pendant 1 min et retirez le surnageant.
3. Lavez la culture organoïde en ajoutant 1 mL de solution saline tampon de phosphate ou de PBS, mélangez, centrifugez à 1 500 x g pendant 1 min et retirez le surnageant.
4. Fixez les organoïdes en ajoutant 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % et laissez incuber pendant 15 min.
5. Lavez la culture deux fois avec 1 mL de PBS.
6. Perméabiliser la culture en ajoutant 500 μL de PBS + 3 % d’albumine sérique bovine ou BSA + 0,1 % de Triton X 100 pendant 5 min.
7. Ensuite, laver trois fois avec 1 mL de PBS + 3 % BSA.
8. Incuber pendant 1 h avec des anticorps primaires contre la synaptophysine (SYP) à une dilution de 1/600 ou la chromogranine A (CgA) et le récepteur de la somatostatine 2 (SSTR2) à une dilution de 1/400 dans un tampon d’anticorps (2,5 % d’albumine sérique bovine, 0,1 % d’azoture de sodium, 25 mM de Tris pH 7,4, 150 mM de chlorure de sodium).
   REMARQUE : Utilisez 300 μL ou plus de solution d’anticorps par tube.
9. Laver trois fois avec 1 mL de PBS + 3 % de BSA.
10. Incuber avec des anticorps secondaires couplés à FITC à une dilution de 1/500 dans un tampon d’anticorps pendant 1 h. Utiliser 300 μL ou plus de solution d’anticorps par tube.
11. Laver 3 fois avec 1 mL de PBS + 3 % de BSA. Assurez-vous d’aspirer et de jeter tout le surnageant.
12. Ajouter 5 μL de support de montage contenant la coloration nucléaire DAPI.
13. Utilisez une pipette P20 pour transférer 5 μL des sphéroïdes SBNET de l’étape 4.12 sur une lame de verre et scellez-la avec une lamelle.
14. Prenez des images à l’aide d’un microscope fluorescent en utilisant les objectifs 10x, 20x ou 40x.

Matériaux