Mesure du taux de consommation d’oxygène dans des tranches de cerveau de souris aiguës

Résumé

Source : Zhi, L. et al., Mesure du taux de consommation d’oxygène dans des coupes striatales aiguës de souris adultes. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo montre comment mesurer le taux de consommation d’oxygène mitochondrial (OCR) dans des tranches de cerveau striatal de souris. Il détaille les étapes de préparation de la plaque de tissu et de la cartouche du capteur, de leur chargement dans l’analyseur de flux et explique les processus cellulaires sous-jacents aux modèles OCR.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Hydratez les capteurs à cartouche (1 jour avant le test)

1. Ouvrez le kit de test de flux extracellulaire (voir Table des matériaux) et retirez à la fois la cartouche de capteur (verte) et la plaque utilitaire (claire ; Figure 1A). Placez la cartouche du capteur de côté (capteurs vers le haut) et ne touchez pas les capteurs.
2. Ajouter 600 μL de solution d’étalonnage (pH 7,4) dans chaque puits de la plaque utilitaire. Placez la cartouche de capteur sur le dessus de la plaque utilitaire et immergez-les dans la solution d’étalonnage. Assurez-vous que l’encoche triangulaire de l’utilitaire et de la plaque de la cartouche du capteur sont correctement alignées (Figure 1B).
3. Scellez le kit de dosage du flux extracellulaire avec un film d’étanchéité pour empêcher l’évaporation de la solution de calibrant, puis placez-le dans un incubateur à 37 °C non supplémenté en CO₂ ou en oxygène pendant la nuit.

2. Préparez la plaque de tissu (le jour du dos)

1. Ouvrez la microplaque de capture d’îlot et sortez la plaque d’îlot pour la pose de tissu.
2. Réchauffer un volume approprié (625 μL par puits) de liquide céphalo-rachidien artificiel modifié pré-oxygéné (ACSF, composition 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 25 mM de glucose, 10 mM HEPES, pH 7,2) tamponner à 37 °C dans un tube de 50 mL. Ajoutez ensuite de la BSA à une concentration finale de 4 mg/mL pour préparer le tampon respiratoire. En général, 50 ml suffisent pour une assiette.
3. Ajouter 625 μL de tampon respiratoire (tampon ACSF pré-oxygéné avec 25 mM de glucose et 4 mg/mL de BSA) dans chaque puits de la plaque d’îlot et éviter de secouer la plaque. Assurez-vous qu’aucune goutte résiduelle ne se trouve sur le dessus de la cartouche du capteur et qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le tampon de chaque puits.

3. Préparation aiguë de la tranche striatale et placement de la tranche excisée

1. Décapiter la souris après une luxation cervicale et disséquer immédiatement le cerveau dans 10 mL de solution de coupe pré-oxygénée glacée (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 3,7 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM de glucose, pH 7,4).
2. Sectionner des tranches de striatum coronaire avec un vibratome en suivant les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux) à une épaisseur de 150 μm dans une solution de coupe glacée et pré-oxygénée.
3. Récupérer les tranches dans 50 mL d’ACSF oxygéné (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,4 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, 0,3 mM KH₂PO₄, 10 mM de glucose, 2 mM HEPES, pH 7,4) et conserver en solution jusqu’à 30 min à température ambiante (RT).
4. Après la récupération, transférez les tranches dans une boîte de Pétri de 35 mm x 10 mm avec 5 ml de tampon respiratoire.
5. À l’aide d’un poinçon de biopsie en acier inoxydable (par ex. un diamètre de 1,5 mm) pour créer un morceau de tissu circulaire dans la région souhaitée du cerveau tranché. Gardez la tranche dans le tampon tout en appuyant doucement avec le poinçon. Assurez-vous que le poinçon est enfoncé assez fort pour couper le tissu. Retirez le reste du tissu, soulevez le poinçon et retirez le morceau de tissu circulaire dans le tampon.
6. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 ml pour faire un trou d’un diamètre de 1,5 à 2,0 mm et utilisez-la pour tenir et transférer la tranche perforée vers le haut de l’écran de capture. Aspirez un morceau de tissu cérébral perforé et placez-le soigneusement sur le côté grillagé de l’écran de capture (Figure 2A). L’écran de capture sera un morceau de plastique circulaire avec le filet attaché d’un côté.
   REMARQUE : Les écrans de capture sont inclus dans le pack de microplaques (voir Table des matériaux).
7. À l’aide d’un mouchoir en papier, séchez brièvement l’écran de capture. Une fois l’humidité éliminée, le tissu devient collant, ce qui permet à la tranche de se fixer au centre du filet. Ne séchez pas trop la tranche, car elle serait autrement endommagée.
8. Tenez l’écran de capture côté tranche vers le bas à l’aide d’une pince à épiler et placez-le dans l’un des puits de la plaque d’îlot en incubation (Figure 2B). Attention à ne pas laisser tomber la tranche ; Si c’est le cas, retirez l’écran et placez-y une nouvelle tranche.
   REMARQUE : Ne placez pas de tranches de cerveau dans les deux puits de correction d’arrière-plan (A1 et D6) dans la plaque de l’îlot.
9. Incuber la plaque d’îlot à 37 °C dans un incubateur pendant au moins 30 minutes pour permettre l’équilibre de la température et du pH avant d’effectuer le test.

4. Chargement des cartouches avec les composés souhaités

1. Diluez les composés souhaités dans de l’ACSF modifié (37 °C) jusqu’à la concentration finale de stock de 10x, 11x, 12x et 13x de la concentration de travail pour les ports A à D, respectivement, et ajustez à pH 7,4. L’essai administrera les composés dans l’ordre de l’orifice A à l’orifice D. Pour cette expérience, les solutions suivantes ont été utilisées, avec leur concentration de travail respective mentionnée avant elles : 10 mM de pyruvate (port A), 20 μM d’oligomycine (port B), 10 μM ou d’autres concentrations de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) (port C) et 20 μM d’antimycine A (port D).
2. Préchargez doucement 75 μL des composés dilués dans les orifices d’injection appropriés de la cartouche du capteur. Placez les pointes à mi-chemin dans les orifices d’injection à un angle de 45° avec l’embout contre la paroi de l’orifice d’injection. Les embouts ne doivent pas être insérés complètement au bas des orifices d’injection, car cela pourrait provoquer des fuites de composé à travers l’orifice.
3. Retirez soigneusement les pointes des ports pour éviter de créer des bulles d’air. Ne tapotez aucune partie de la cartouche pour éviter d’atténuer les bulles d’air.
4. Inspectez visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme. Assurez-vous que tout le liquide se trouve dans l’orifice et qu’aucune goutte résiduelle n’est présente sur le dessus de la cartouche.
5. Placez la cartouche du capteur sur la plaque d’utilisation et placez-la dans un incubateur (sans CO₂) pendant 30 minutes pour lui permettre de chauffer à nouveau jusqu’à 37 °C. Manipulez avec précaution en ne tenant que la plaque utilitaire. Bougez le moins possible.

5. Étalonnage et réalisation du test

1. Chargez le modèle de test dans le logiciel. Appuyez sur le bouton vert START .
2. Assurez-vous de charger le protocole correct. Le protocole contient une combinaison de séquences de mixage de 3 minutes, d’attente de 3 minutes et de mesures de 2 minutes (ces trois étapes forment une seule mesure). Modifiez la distance de la tête de sonde de 26 600 à 27 800 dans les paramètres matériels sous les paramètres de l’instrument. Il n’est pas nécessaire de changer la tête de sonde de l’analyseur XFe24. Appuyez sur START.
3. Chargez la cartouche de capteur sur la plaque utilitaire dans le plateau d’instruments. L’encoche passe dans le coin avant gauche. Assurez-vous que la plaque est correctement placée et plate. Chargez la cartouche de capteur remplie de médicament dans l’analyseur pour l’étalonnage.
4. Suivez les instructions à l’écran pour calibrer et équilibrer les capteurs. Cela prend environ 30 min.
5. Une fois l’étape de calibrage terminée, retirez la plaque d’étalonnage et remplacez-la par la plaque d’îlot (contenant le treillis et les tranches de tissu).
6. Mesurez la consommation d’oxygène dans chaque puits de la plaque à l’aide des protocoles d’analyse. Le protocole contient une combinaison de séquences de 3 minutes de mixage, 3 minutes d’attente et 2 minutes de mesure (ces trois étapes forment une seule mesure), après quoi le taux de consommation d’oxygène (OCR) est calculé.
7. Pour l’ensemble de l’expérience, incluez 4 mesures OCR pour créer une base de référence, suivies de l’injection du port A (pyruvate) avec des mesures 4x, puis de l’injection du port B (oligomycine) avec des mesures 8x, puis de l’injection du port C (FCCP) avec des mesures 5x, et, enfin, de l’injection du port D (antimycine A) avec des mesures 6x.
   REMARQUE : Ce nombre de mesures après chaque injection de composé est déterminé en fonction du moment où la mesure atteint le plateau.
8. Analysez les données de mesure OCR et les données d’efficacité de couplage.

Résultats

Figure 1 : Images montrant les capteurs et la plaque de la cartouche d’hydrate de l’analyseur de flux extracellulaire. (A) La cartouche de capteur posée sur une plaque d’étalonnage (plaque utilitaire). (B) Vue latérale d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accumet AB150 pH-mètre de paillasse	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	Pour mesurer le pH
Antimycin A from Streptomyces sp.	SIGMA	A8674	Pour inhiber le complexe III des mitochondries
Albumine sérique bovine (BSA)	SIGMA	A6003	Pour faire du liquide céphalo-rachidien artificiel modifié (BSA-ACSF)
Cyanure de carbonyle 4-( trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	Pour découpler la respiration mitochondriale
D-Glucose	SIGMA	G8270	Pour faire du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	Pour dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	Pour faire du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
Incubateur humidifié sans dioxyde de carbone	Fisher Scientific	11-683-230D	Pour hydrater les plaques à 37 °C
Oligomycine de Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	Pour inhiber l’ATP synthase mitochondriale
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		film d’étanchéité
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution pour l’étalonnage de l’hippocampe
Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF	Seahorse Bioscience		Équipement utilisé pour analyser le taux de consommation d’oxygène, ancienne génération
Hippocampe XFe24 Analyseur de flux extracellulaire	Seahorse Bioscience		Équipement utilisé pour analyser le taux de consommation d’oxygène, nouvelle génération<
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Paquet de cartouches de capteur d’analyseur de flux, de plaques de culture tissulaire, d’écrans de capture, de solution d’étalonnage et de plaques d’étalonnage ; kit de test.
Pyruvate de sodium	SIGMA	P2256	Pour éviter toute contrainte limitant le substrat de l’approvisionnement en substrat
Poinçons de biopsie en acier inoxydable	Miltex		Appareil utilisé pour perforer des tranches
Boîte de culture cellulaire stérile, 35 x 10 mm	Eppendrof	30700102	Utilisé pour le poinçonnage de tranches
Vibratome	Leica	VT1200	Pour trancher le tissu cérébral
Bain d’eau	Thermo Scientific Precision	282-115	Pour chauffer le tampon et les solutions

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