Mesures basées sur l’impédance de l’invasion des cellules cancéreuses du cerveau

Résumé

Source : Mudduluru, G., et. al. Mesure en temps réel de la migration et de l’invasion des cellules cancéreuses basée sur l’impédance. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente un test basé sur l’impédance pour mesurer l’invasion et la migration des cellules de glioblastome. Les cellules dégradent la matrice extracellulaire, se déplacent à travers des membranes microporeuses et adhèrent aux électrodes, générant ainsi de l’impédance. Cette analyse en temps réel reflète leur potentiel invasif pour les applications de la recherche sur le cancer.

Protocole

1. Préparation du système d’analyse de cellules en temps réel, des plaques d’invasion et de migration de cellules (CIM) et des cellules U-118MG électroporées pour le placage

1. Place le système d’analyse de cellules en temps réel dans un CO₂ incubateur dans des conditions de culture 5–6 h avant le début de l’expérience pour stabiliser le système aux conditions de culture.
2. Pour l’essai d’invasion, mettre sur une plaque 50 μL de DMEM (milieu ordinaire) contenant un gel de matrice extracellulaire (ECM) à raison de 0,1 μg/μL dans chaque puits de la chambre supérieure de la plaque CIM. Pour éviter d’avoir des bulles d’air, utilisez la méthode de pipetage inversé. Retirez immédiatement 30 μL de gel ECM, en laissant 20 μL dans le puits.
3. Après l’enrobage de gel ECM, conservez la plaque dans l’incubateur dans des conditions de culture pendant 4 h avec son couvercle fermé. Pendant le revêtement et le séchage du gel ECM, prenez des mesures préventives pour éviter tout contact direct avec les électrodes de la chambre supérieure des plaques avec les mains, les surfaces de l’enceinte de biosécurité ou le CO₂ incubateur.
4. Pour configurer le programme de mesure d’impédance, double-cliquez sur l’icône du logiciel associé (voir Table of Materials) pour ouvrir l’application logicielle système (unité de contrôle). Chaque socle dispose d’une fenêtre individuelle avec différents onglets pour définir les conditions expérimentales, l’impédance mesure de l’intervalle de temps et de la durée, et l’analyse des données.
5. Sous le Layout l’onglet, définissez des puits quadruples pour chaque condition biologique et définissez les mesures d’impédance de cellule en deux étapes sous le Schedule tab. La première étape consiste à effectuer une mesure de référence unique (un balayage avec un intervalle de 1 minute), et la deuxième étape consiste à mesurer l’impédance des cellules dans les berceaux individuels respectifs pour une expérience réelle. Pour la migration, utilisez 145 balayages avec un intervalle de 10 minutes, et pour l’invasion, 577 balayages avec un intervalle de 10 minutes, réglés individuellement) dans les berceaux individuels respectifs.
6. Une heure avant le début de la mesure de l’impédance de la cellule, ajoutez 160 μL de DMEM avec 10 % de FBS comme chimioattractant dans les puits de la chambre inférieure de la plaque. Assemblez soit la chambre supérieure contenant les puits revêtus de gel ECM, soit les puits non revêtus avec la chambre inférieure pour mesurer l’invasion et la migration, respectivement.
7. Remplissez les puits de la chambre supérieure avec 50 μL de milieu à faible teneur sérique et placez-les dans le berceau du système. Vérifiez si tous les puits sont reconnus par l’unité de contrôle en cliquant sur le Message tab. Si le message s’affiche comme suit OK, la plaque dans le berceau est prête pour l’expérience.
8. Préincubez les plaques complètement emballées dans l’incubateur dans des conditions de culture pendant 1 h avant les mesures dans le berceau du système d’analyse cellulaire en temps réel, ce qui est essentiel pour l’acclimatation d’une plaque garnie aux conditions de culture cellulaire.
9. Pour le prélèvement de cellules traitées avec un milieu à faible teneur en sérum, laver les cellules en croissance dans des boîtes de culture avec 1x PBS et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % (acide éthylènediaminetétraacétique). Placez dans l’incubateur pendant 30 secondes et retirez la trypsine-EDTA. Collecter les cellules dans le low serum medium dans un tube de 15 mL et compter les cellules utilisant un compteur de cellules automatisé portable.
10. Après avoir compté, centrifuger les cellules à 100 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
11. Remettre en suspension 800 000 cellules dans 800 μL de milieu sérique faible pour les tests de migration et d’invasion. De plus, remettre en suspension 300 000 cellules dans 2 mL de milieu de culture et semer dans une boîte de 35 mm pour une analyse par transfert Western afin de confirmer l’inactivation régulée de Crk et CrkL.

2. Lecture de la ligne de base, ensemencement des cellules et mesure et visualisation de l’impédance des cellules

1. Mesurez la lecture de la ligne de base en cliquant sur le socle StartNOTE : Une fois le berceauStart bouton est cliqué, l’unité de contrôle vous demandera si vous souhaitez enregistrer le fichier expérimental. Une fois le fichier enregistré, l’analyseur de socle mesure initialement l’impédance de la cellule de base telle que définie dans le programme et passe en mode pause jusqu’à ce que le socle Démarrer bouton est cliqué à nouveau pour mesurer l’impédance de la cellule dans la deuxième étape.
2. Retirez les deux plaques des berceaux pour la migration et l’invasion après la mesure de base et conservez-les dans l’enceinte de biosécurité.
3. Ensemencez 100 μL de cellules (100 000 cellules) en quadrilicats pour chaque condition biologique dans la chambre supérieure de la plaque CIM dans les puits respectifs, comme programmé dans l’unité de contrôle du berceau par pipetage inverse pour éviter les bulles d’air.
4. Après l’ensemencement, conservez la plaque sous une enceinte de biosécurité pendant 30 minutes à température ambiante pour permettre aux cellules de se déposer uniformément vers le fond. Transférez la plaque dans la station d’accueil correspondante et cliquez sur le bouton de démarrage de la station pour commencer à mesurer l’impédance de la cellule comme programmé dans la deuxième étape de 1.5.
5. Après le dernier balayage, l’expérience est terminée et les résultats sont enregistrés automatiquement.
6. Sous le Data Analysis onglet, visualisez les changements d’impédance de cellule sous forme d’indice de cellule en fonction du temps pendant ou après la fin de l’expérience. Chacune des conditions respectives des quadruplés peut être visualisée soit individuellement, soit sous forme de moyennes et/ou d’écarts-types en cliquant sur le Options cases pour la moyenne et l’écart-type.
7. Pour exporter les données d’index de cellule vers un fichier de feuille de calcul, ouvrez un fichier de feuille de calcul vide, placez le curseur au milieu de la Analyse des données fenêtre et cliquez avec le bouton droit de la souris. Dans la boîte de dialogue qui apparaît, choisissez l’option Copier les données dans le format de liste, puis collez les données dans la feuille de calcul ouverte.
8. Ajustez le temps dans les données brutes pour représenter l’heure de début réelle de la mesure de l’impédance de la cellule. L’heure de début de la deuxième étape est définie sur zéro.
   NOTE : L’unité de contrôle a la possibilité d’obtenir l’indice de cellule avec ou sans normalisation (c’est-à-dire l’indice de cellule normalisé) et de visualiser les résultats sous forme de présentation graphique en fonction du temps. Dans cet exemple, les données d’index de cellule sont exportées sans normalisation pour le traitement et la présentation graphique.
9. Lancez l’expérience en cliquant sur le Release bouton dans chaque socle.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Enceinte de biosécurité	ThermoFisher Scientific	1300 Series Class II, Type A2
plaques CIM	Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc	5665825001	Plaques d’invasion et de migration cellulaires
Medium modifié de Dulbecco (DMEM)	ATCC	302002	Milieu de culture utilisé pour la cellule culture
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)	Gibco	21-031-CV	DPBS used to wash the cells
Sérum fœtal bovin (FBS)<	SH30910.03
Incubateur de dioxyde de carbone Heracell VIOS 160i	ThermoFisher Scientific	51030285	Incubateur
Matrigel	BD Bioscience	354234	Gel
logiciel RTCA	Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc		Instrument utilisé pour l’expérimentation
Scepter	Millipore	C85360	Compteur
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	<
ATCC	ATCC HTB15	Lignées cellulaires utilisées pour les expériences
xCELLigence RTCA DP	Division d’analyse cellulaire d’Agilent Technologies, Inc	380601050

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