Développement d’un modèle de pression translaminaire à l’aide d’un système autonome translaminaire

Abstract

Source : Sharma, T. P., et al., Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs du donneur humain. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo montre la procédure de préparation d’un œil humain pour étudier les effets de la pression translaminaire sur la signalisation des cellules ganglionnaires rétiniennes en simulant les pressions intraoculaires et intracrâniennes dans un système autonome translaminaire.

Protocol

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Préparation et stérilisation de l’équipement et des fournitures

1. Reportez-vous à la Table des matériaux pour obtenir la liste complète des fournitures requises ainsi que les numéros de fournisseur et de catalogue.
2. Avant utilisation, stérilisez tous les équipements et instruments par autoclave ou à l’aide d’ampoules d’oxyde d’éthylène.

2. Préparation du milieu

1. de perfusionAjouter 1 % de pénicilline-streptomycine (10,000 U/mL de pénicilline, 10,000 μg/mL de streptomycine dans 0,85 % de NaCl) et 1 % de L-glutamine (200 mM) à 1,000 mL de milieu modifié de Dulbecco’s Eagle à haute teneur en glucose (DMEM).
2. Stérilisez le milieu de perfusion en passant à travers un filtre de 0,22 μm.

3. Configuration

1. du système autonome translaminaire (TAS)Configurer les seringues d’entrée (réservoirs de pression intraoculaire (IOP) et de pression intracrânienne (ICP)).
   1. Ajouter 30 mL de milieu de perfusion (section 2) à une seringue de 30 mL. Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à la seringue de 30 ml. Fixez un filtre hydrophile de 0,22 μm au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez un adaptateur de talon Luer 15 G au filtre hydrophile de 0,22 μm.
   2. Supprimez les bulles d’air de la configuration de la seringue. Fixez le tube à l’adaptateur d’embout Luer 15 G. Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt à l’aide d’un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations.
   3. Étiquetez une seringue comme pression intracrânienne du canal 1 (CH1 ICP) et l’autre seringue comme pression intraoculaire du canal 2 (CH2 IOP).
2. Configurer les seringues d’écoulement (réservoirs IOP et ICP).
   1. Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à une seringue de 30 ml. Fixez un adaptateur d’embout Luer 15 G au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez le tube à l’adaptateur d’embout Luer 15 G.
   2. Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt avec un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations. Étiquetez une seringue comme CH1 ICP et l’autre seringue comme CH2 IOP.

4. Préparation du globe oculaire entier humain

REMARQUE : Si vous recevez des yeux entiers, suivez la procédure ci-dessous pour séparer le segment antérieur du segment postérieur de l’œil. Si les yeux sont reçus coupés en deux, commencez à l’étape 4.4.

1. Placez un œil entier dans la solution de povidone iodée pendant 2 min.
2. Rincez l’œil dans une solution tamponnée au phosphate stérile (PBS) pour éliminer la povidone iodée. Répétez l’opération deux fois.
3. Retirez l’annexe de tout le globe oculaire à l’aide de pinces et de ciseaux. Coupez l’œil en deux à l’équateur pour séparer les segments antérieur et postérieur de l’œil.
4. Retirez la gaine du nerf optique. Retirez l’humeur vitrée du segment postérieur.
5. Coupez des sclères supplémentaires du segment postérieur, si nécessaire, pour assurer un bon ajustement sur le dôme rond de la chambre IOP (inférieure). À l’aide d’une pince, assurez-vous que la rétine est répartie uniformément sur la partie postérieure du segment.
6. Configuration de la chambre IOP (en bas)
   1. Place le segment postérieur humain dans la chambre IOP (en bas) du TAS sur le dôme rond avec le nerf optique face au haut.
   2. Scellez le segment postérieur à l’aide du joint torique en résine époxy avec quatre vis, assurant une étanchéité parfaite.
   3. Insérez le tube dans les ports IN et OUT de la chambre IOP (inférieure). La seringue d’entrée IOP avec tube contenant du fluide est insérée dans l’orifice IN et la seringue de sortie IOP vide avec tube est insérée dans l’orifice OUT.
   4. Utilisez la méthode push/pull pour infuser lentement le milieu de perfusion dans l’orifice d’entrée afin de remplir l’œilleton postérieur tout en tirant lentement le milieu de perfusion à travers la seringue de sortie pour éliminer toutes les bulles d’air des lignes. Arrêtez d’infuser le milieu une fois que les tubes IN et OUT sont exempts de bulles d’air.
   5. Verrouille les robinets en position d’arrêt. Retirez la seringue de 30 ml de l’ensemble de filtre de l’orifice IOP IN et remplissez-la avec 30 ml de fluide. Ensuite, remplacez la seringue par l’ensemble de filtre.
7. Configuration de la chambre ICP (en haut)
   1. Place la chambre/couvercle ICP (en haut) sur l’arrière du segment postérieur. Assurez-vous que le nerf optique se trouve à l’intérieur de la chambre supérieure. Scellez la chambre supérieure avec quatre vis.
   2. Insérez le tube dans les ports IN et OUT de la chambre ICP (en haut). La seringue d’entrée ICP avec tube contenant du fluide est insérée dans l’orifice IN et la seringue de sortie ICP vide avec tube est insérée dans l’orifice OUT.
   3. Infusez doucement et lentement le fluide dans le port IN pour remplir la chambre ICP et éliminer les bulles d’air des conduites en utilisant la méthode push/pull. Arrêtez d’infuser le fluide une fois que la chambre ICP et les tubes IN et OUT sont exempts de bulles d’air.
   4. Verrouille les robinets en position d’arrêt. Retirez la seringue de 30 ml de l’ensemble de filtre ICP dans l’orifice et remplissez-la avec 30 ml de fluide. Ensuite, remplacez la seringue par l’ensemble de filtre.

Materials