Développement d’un modèle de pression translaminaire à l’aide d’un système autonome translaminaire

Résumé

Source : Sharma, T. P., et al., Modèle de système autonome translaminaire pour la modulation de la pression intraoculaire et intracrânienne dans les segments postérieurs du donneur humain. J. Vis. Exp. (2020).

Cette vidéo montre la procédure de préparation d’un œil humain pour étudier les effets de la pression translaminaire sur la signalisation des cellules ganglionnaires rétiniennes en simulant les pressions intraoculaires et intracrâniennes dans un système autonome translaminaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Préparation et stérilisation de l’équipement et des fournitures

1. Reportez-vous à la Table des matériaux pour obtenir la liste complète des fournitures requises ainsi que les numéros de fournisseur et de catalogue.
2. Avant utilisation, stérilisez tous les équipements et instruments par autoclave ou à l’aide d’ampoules d’oxyde d’éthylène.

2. Préparation du milieu

1. de perfusionAjouter 1 % de pénicilline-streptomycine (10,000 U/mL de pénicilline, 10,000 μg/mL de streptomycine dans 0,85 % de NaCl) et 1 % de L-glutamine (200 mM) à 1,000 mL de milieu modifié de Dulbecco’s Eagle à haute teneur en glucose (DMEM).
2. Stérilisez le milieu de perfusion en passant à travers un filtre de 0,22 μm.

3. Configuration

1. du système autonome translaminaire (TAS)Configurer les seringues d’entrée (réservoirs de pression intraoculaire (IOP) et de pression intracrânienne (ICP)).
   1. Ajouter 30 mL de milieu de perfusion (section 2) à une seringue de 30 mL. Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à la seringue de 30 ml. Fixez un filtre hydrophile de 0,22 μm au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez un adaptateur de talon Luer 15 G au filtre hydrophile de 0,22 μm.
   2. Supprimez les bulles d’air de la configuration de la seringue. Fixez le tube à l’adaptateur d’embout Luer 15 G. Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt à l’aide d’un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations.
   3. Étiquetez une seringue comme pression intracrânienne du canal 1 (CH1 ICP) et l’autre seringue comme pression intraoculaire du canal 2 (CH2 IOP).
2. Configurer les seringues d’écoulement (réservoirs IOP et ICP).
   1. Fixez un robinet d’arrêt à 3 voies à une seringue de 30 ml. Fixez un adaptateur d’embout Luer 15 G au robinet d’arrêt à 3 voies. Fixez le tube à l’adaptateur d’embout Luer 15 G.
   2. Fermez l’orifice latéral du robinet d’arrêt avec un capuchon de verrouillage universel non ventilé. Répétez l’opération pour un total de deux configurations. Étiquetez une seringue comme CH1 ICP et l’autre seringue comme CH2 IOP.

4. Préparation du globe oculaire entier humain

REMARQUE : Si vous recevez des yeux entiers, suivez la procédure ci-dessous pour séparer le segment antérieur du segment postérieur de l’œil. Si les yeux sont reçus coupés en deux, commencez à l’étape 4.4.

1. Placez un œil entier dans la solution de povidone iodée pendant 2 min.
2. Rincez l’œil dans une solution tamponnée au phosphate stérile (PBS) pour éliminer la povidone iodée. Répétez l’opération deux fois.
3. Retirez l’annexe de tout le globe oculaire à l’aide de pinces et de ciseaux. Coupez l’œil en deux à l’équateur pour séparer les segments antérieur et postérieur de l’œil.
4. Retirez la gaine du nerf optique. Retirez l’humeur vitrée du segment postérieur.
5. Coupez des sclères supplémentaires du segment postérieur, si nécessaire, pour assurer un bon ajustement sur le dôme rond de la chambre IOP (inférieure). À l’aide d’une pince, assurez-vous que la rétine est répartie uniformément sur la partie postérieure du segment.
6. Configuration de la chambre IOP (en bas)
   1. Place le segment postérieur humain dans la chambre IOP (en bas) du TAS sur le dôme rond avec le nerf optique face au haut.
   2. Scellez le segment postérieur à l’aide du joint torique en résine époxy avec quatre vis, assurant une étanchéité parfaite.
   3. Insérez le tube dans les ports IN et OUT de la chambre IOP (inférieure). La seringue d’entrée IOP avec tube contenant du fluide est insérée dans l’orifice IN et la seringue de sortie IOP vide avec tube est insérée dans l’orifice OUT.
   4. Utilisez la méthode push/pull pour infuser lentement le milieu de perfusion dans l’orifice d’entrée afin de remplir l’œilleton postérieur tout en tirant lentement le milieu de perfusion à travers la seringue de sortie pour éliminer toutes les bulles d’air des lignes. Arrêtez d’infuser le milieu une fois que les tubes IN et OUT sont exempts de bulles d’air.
   5. Verrouille les robinets en position d’arrêt. Retirez la seringue de 30 ml de l’ensemble de filtre de l’orifice IOP IN et remplissez-la avec 30 ml de fluide. Ensuite, remplacez la seringue par l’ensemble de filtre.
7. Configuration de la chambre ICP (en haut)
   1. Place la chambre/couvercle ICP (en haut) sur l’arrière du segment postérieur. Assurez-vous que le nerf optique se trouve à l’intérieur de la chambre supérieure. Scellez la chambre supérieure avec quatre vis.
   2. Insérez le tube dans les ports IN et OUT de la chambre ICP (en haut). La seringue d’entrée ICP avec tube contenant du fluide est insérée dans l’orifice IN et la seringue de sortie ICP vide avec tube est insérée dans l’orifice OUT.
   3. Infusez doucement et lentement le fluide dans le port IN pour remplir la chambre ICP et éliminer les bulles d’air des conduites en utilisant la méthode push/pull. Arrêtez d’infuser le fluide une fois que la chambre ICP et les tubes IN et OUT sont exempts de bulles d’air.
   4. Verrouille les robinets en position d’arrêt. Retirez la seringue de 30 ml de l’ensemble de filtre ICP dans l’orifice et remplissez-la avec 30 ml de fluide. Ensuite, remplacez la seringue par l’ensemble de filtre.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#122, 1-1/8 » Inside x 1-5/16 » Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32 » Epaisseur, 755 Durometer 50 Pack	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Joint torique Buna-N, duromètre 70A, noir, 5/8 » ID, 13/16 » OD, 3/32 » Largeur (paquet de 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL Seringues sans aiguille	Vitality Medical	302832
Robinet d’arrêt à 3 voies, 2 Luer Locks femelles, Luer Lock mâle pivotant, capuchon ventilé	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & tournevis cruciforme de taille appropriée	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm traité par culture tissulaire Culture des plats	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Éponge de gaze Curity, 4 » x 4 », 12 plis, stérile, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Pince à pansement Délicate Courbée (dentelée)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Boxes	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Dulbecco’s Modified Eagles Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Filtre hydrophile avec entrée Luer Lock femelle, sortie Luer Slip mâle, bleu et transparent	Qosina	28217
Transducteurs de pression hydrostatiques, DELTRAN ® II, Catalogue # DPT-200 avec un débit de 3CC/HR	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX Calibre 15 0.5" NT Premium Series Pointe de distribution 50/boîte	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2‐X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Capuchon Luer Lock universel non ventilé, blanc	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Modèle # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
solution tamponnée de phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Modèle # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant avec DAPI	ThermoFisher	P36935
Raccord de tube push-to-connect pour adaptateur droit d’air et d’eau, 1/8" OD de tube x 1/8 NPT mâle	McMAster-Carr	7880T113
Raccord de tube Push-to-Connect avec filetage universel pour l’air et l’eau, adaptateur, tube 1/8" OD x 1/8 tuyau	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Tube flexible 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Ciseaux chirurgicaux - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
Pince à tissus Delicate 1x2 Teeth Curved	Katena	K5-4110
Système autonome translaminaire (TAS)	Centre des sciences de la santé de l’Université du nord du Texas	N/A
USA Taille 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030

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