Cette vidéo présente un test permettant d’étudier la capacité phagocytaire des cellules microgliales à l’aide de synaptosomes marqués à un colorant fluorescent sensibles au pH.
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Article de méthode
Dosage de la phagocytose sur cellules vivantes de cellules de type microglie à l’aide de synaptosomes humains
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28 avril 2025
Dans cet article
Résumé
Protocole
- Test de phagocytose sur cellules vivantes
- Plaque 20-30 × 104 PMPs dans des plaques de 96 puits dans 100 μL de milieu complet iMG et suivez le processus de différenciation pendant 10 jours.
- Le jour du test, préparez la solution de coloration nucléaire en ajoutant 1 goutte d’un colorant nucléaire pour cellules vivantes dans 2 mL de milieu basal iMG.
- Retirez 40 μL de fluide par puits de la plaque à 96 puits et ajoutez 10 μL de la solution de coloration nucléaire à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 2 h.
- Décongelez les synaptosomes marqués sur de la glace et sononisez doucement à l’aide d’un sonicateur d’eau pendant 1 min. Transférez immédiatement les synaptosomes sur la glace. Diluer les synaptosomes marqués dans le milieu complet iMG à raison de 1 μL de synaptosomes pour 50 μL de milieu.
REMARQUE : La concentration du synaptosome dépend du test et peut nécessiter une optimisation. Pour maintenir un pourcentage relativement faible (c.-à-d. 0,1 % ou moins) de DMSO dans le milieu, il est conseillé de ne pas ajouter plus de 2 μL de synaptosomes par puits. - En tant que contrôle négatif, prétraitez certains puits avec de la cytochalasine D pour inhiber la polymérisation de l’actine et, par conséquent, la phagocytose. Préparez une solution de cytochalasine D à 60 μM dans un milieu complet iMG. Ajouter 10 μL de cette solution dans chaque puits pour une concentration finale de 10 μM et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Retirez la plaque de l’incubateur et incubez à 10 °C pendant 10 min. Maintenez la plaque sur de la glace et ajoutez 50 μL de milieu contenant des synaptosomes.
- Centrifugez la plaque à 270 × g pendant 3 min à 10 °C et maintenez la plaque sur la glace jusqu’à l’acquisition de l’imagerie.
- Acquisition et analyse d’imagerie
- Insérez la plaque dans un lecteur d’imagerie de cellules vivantes et sélectionnez les puits à analyser.
- Sélectionnez un objectif 20x.
- Ajustez la mise au point, l’intensité des diodes électroluminescentes (LED), le temps d’intégration et le gain des canaux fond clair et bleu (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]). La fluorescence des synaptosomes doit être négligeable au point temporel initial. Utilisez le canal en fond clair comme référence pour vous concentrer sur le canal rouge (RFP). Le temps et le gain d’intégration peuvent varier d’une expérience à l’autre ; utilisez ces paramètres initiaux pour le canal rouge : LED : 4, temps d’intégration : 250 et gain : 5.
- Sélectionnez le nombre de tuiles individuelles à acquérir dans un montage par puits (par exemple, acquérez 16 tuiles au centre du puits, imaginant ainsi environ 5 % de la surface totale du puits). Réglez la température à 37 °C et l’intervalle de temps souhaité pour l’imagerie.
REMARQUE : Les images ont été acquises toutes les 1 à 2 h pendant un maximum de 16 h dans cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériaux de culture cellulaire | < | ||
| Microplaque à fond plat transparent Primaria 96 puits | Corning | 353872 | |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Réservé à laminin 521 |
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | Final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Concentration finale 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | Concentration finale 1x |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Gibco | 15140122 | Concentration finale 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | < | ||
| Gibco | 21985023 | Concentration finale 55 μM | |
| IL-34 | PeproTech ou Biologend | 200-34 ou 577904 | Concentration finale 100 ng/mL |
| iMG base media | Concentration finale 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Concentration finale 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | Concentration finale 50 ng/mL |
| Colorants de dosage de la phagocytose | < | ||
| Invitrogen | R37605 | ||
| pHrodo Rouge, ester succinimidylique | ThermoFisher Scientific | P36600 | Réservé au colorant |
| Autres réactifs de culture cellulaire | |||
| Cytochalasine D | Sigma | < | |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge< | Model 5810R | ||
| lecteur d’imagerie de cellules vivantes Cytation 5 | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 |
