Détection du cotransporteur neuronal phosphorylé de chlorure de potassium 2 par Western Blot

Résumé

Source : Josiah, S. S., et al. Étude des fonctions et des activités du cotransporteur neuronal K-CL KCC2 à l’aide du Western Blot. J. vis. exp. (2022).

La vidéo montre les étapes de détection et de quantification de la protéine phosphorylée du cotransporteur 2 du chlorure de potassium (KCC2) dans un lysat cellulaire. Ce processus implique une immunoprécipitation pour isoler KCC2 phosphorylé et une chimiluminescence pour quantifier la protéine isolée.

Protocole

1. Culture cellulaire et transfection

1. Chauffez tous les réactifs dans le bain de billes (37 °C) avant la procédure de culture cellulaire. Préparez le milieu de culture, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de 2 mM de L-glutamine, 100 % d’acide aminé non essentiel, 100 mM de pyruvate de sodium et 100 unités/mL de pénicilline-streptomycine.
2. Décongelez complètement les cellules embryonnaires de rat KCC2b (HEK293^rnKCC2b) complètement dans le bain de billes (37 °C). Transférez les cellules du tube cryoviral dans un tube à centrifuger contenant 5 mL de milieu frais. Faites tourner la cellule à 1200 ×g pendant 3 à 5 min.
3. Utilisez une pipette aspirateur (fixée à une pompe à vide) pour aspirer le surnageant et ajoutez 10 ml de milieu frais pour remettre les cellules en suspension. Transférez la suspension cellulaire sur une assiette à vaisselle de 10 cm.
4. Placez la parabole dans l’incubateur et laissez-la pousser pendant 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂. Surveillez la période d’incubation pour assurer une croissance cellulaire saine. Divisez davantage les cellules lorsqu’elles ont atteint plus de 90 % de confluence après la période d’incubation.
5. Aspirez l’ancien milieu de la boîte de cellules et rincez doucement les cellules avec 2 ml de solution saline tampon de phosphate (PBS). Ajouter 2 ml de trypsine et incuber environ 1 à 2 minutes à température ambiante.
6. À l’aide de 2 ml de milieu complet, lavez délicatement les cellules trypsinisées dans le plat. Ajouter 9 ml de milieu frais dans les nouveaux plats et ajouter 1 ml de solution de l’ancien plat à chacun des nouveaux. Transférez les boîtes à cellules divisées dans l’incubateur pendant 48 h pour atteindre ≥ de 90 % de confluence.
7. Traitez les cellules avec soit du diméthylsulfoxyde (DMSO) comme témoin, 8 μM de staurosporine, soit 0,5 mM de N-éthylmaléimide (NEM) pendant 15 min avant de récolter les cellules dans le tampon de lyse.

2. Préparation des lysats cellulaires et chargement des échantillons

1. Aspirer le milieu sur la boîte de culture (à partir de procédures de transfection). Placez la culture cellulaire sur de la glace et lavez les cellules avec du PBS glacé.
2. Aspirer le PBS, puis ajouter 1,0 mL de tampon de lyse glacé contenant 50 mM de tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d’éthylène glycol-bis(β-aminoéthyléther aminoéthyl)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique (EGTA), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 50 mM de fluorure de sodium, 5 mM de pyrophosphate de sodium, 10 mM de sodium-β-glycérophosphate, 1 mM d’orthovanadate de sodium, 1 % (p/v) de Triton X-100, 0,27 M de saccharose, 1 mM de benzamine, 0,1 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol et 2 mM de phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF) dans la boîte.
   REMARQUE : Le volume du tampon de lyse pendant la récolte des cellules varie selon la taille des plats, par exemple, 1 mL de tampon de lyse convient pour 1 x 10⁷ cellules/100 mm de boîte/150 cm² flacon, tandis que 0,5 mL convient pour 5 x 10⁶ cellules/60 mm de boîte/75 cm².
3. Utilisez un grattoir à cellules en plastique froid pour gratter les cellules du fond de la boîte, puis utilisez doucement une pipette pour transférer la suspension cellulaire dans un micro-tube de centrifugation déjà sur de la glace. Agitez constamment le tube pendant 30 min à 4 °C.
4. Faites tourner les lysats cellulaires dans une centrifugeuse froide (4 °C) à 16 000 x g pendant 20 min, retirez doucement le tube de la centrifugeuse et placez-le sur de la glace. Recueillir le surnageant dans un tube frais pré-refroidi et jeter la pastille.
   REMARQUE : Il peut être nécessaire de faire varier la force et le temps de centrifugation en fonction du type de cellule. Cependant, les directives générales encouragent la centrifugation à 16 000 x g pendant 20 min. Cependant, cela doit être déterminé pour chaque expérience. Par exemple, les cellules délicates comme les leucocytes ont besoin d’une vitesse de centrifugation très faible.

3. Préparation d’immunoprécipitants à partir de lysats cellulaires

1. Pipette 300 μL de protéine-G-sépharose dans un tube de microcentrifugation. Faites tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jetez le surnageant.
2. Ajouter 500 μL de PBS et bien agiter la solution. Faites tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jetez le surnageant. Répétez cette étape.
3. Mélangez 1 mg d’anticorps anti-KCC2 Thr906 et anti-KCC2 Thr1007 avec 200 μL de billes de protéine G-sépharose et complétez le volume à 500 μL avec du PBS. Agiter sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant 2 h à 4 °C. Laver 2 fois avec du PBS.
4. Effectuez une quantification des protéines sur l’ensemble des lysats cellulaires et ajoutez 1 mg de lysat cellulaire aux billes lavées. Incuber doucement dans un rotateur de bout en bout pendant 2 h à 4 °C. Faites tourner les billes et lavez-les 3 fois avec du PBS contenant 150 mM de chlorure de sodium (NaCl).
5. Laver les immunoprécipitants (billes) 3x avec 200 μL de PBS. Remettre en suspension la pastille finale dans 100 μL de 1x tampon d’échantillon de dodécylsulfate de lithium (LDS).
6. Agitez les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant 5 min et incubez-les dans un bloc chauffant à 75 °C pendant 10 min. Centrifugez l’échantillon de chargement à 11 000 x g pendant 2 min et utilisez le surnageant pour le chargement du gel.

4. Effectuer le transfert ouest

1. Assemblez l’appareil de coulée et versez du gel séparateur à 8 % fraîchement préparé (voir Tableau 1 pour la recette/préparation) pour couler le gel en laissant environ 2 cm d’espace à partir du haut du verre de coulée. Ajoutez 200 μL d’isopropanol absolu à l’installation et laissez-le reposer à température ambiante pendant 60 min.
   REMARQUE : La recette du gel de polyacrylamide pour l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) dépend de la taille de la protéine d’intérêt (Tableau 2). Par conséquent, notez la taille des protéines avant de déterminer le pourcentage de gel souhaité.
2. À l’aide d’une pipette, retirez l’isopropanol et rincez soigneusement le gel avec environ 200 μL d’eau distillée. Ajoutez du gel empilable à 6 % fraîchement préparé (voir Tableau 1 pour la recette/préparation) pour remplir l’espace d’environ 2 cm sur la configuration de coulée. Insérez délicatement le peigne du puits et laissez reposer à température ambiante pendant 30 min.
3. Fixez le gel coulé dans le réservoir d’électrophorèse.
4. Dissoudre 30,3 g de base Tris, 144,1 g de glycine et 10 g de SDS dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer un tampon de transfert 10x. Préparez 1 tampon de fonctionnement en ajoutant 10 ml de SDS à 10 % et 100 ml de tampon de transfert à 890 ml d’eau distillée.
5. Versez 1x tampon de coulée dans le réservoir. Chargez 5 μL de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE (entre 18 et 30 μL, selon la taille du peigne utilisé). Remplissez les puits vides avec 1x LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90-120 min à 120 V.
6. Dissoudre 58,2 g de base Tris et 29,3 g de glycine dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer 10x tampon de transfert. Activer la membrane nitrocellulosique avec 1x tampon de transfert contenant 20 % de méthanol. Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert et étalez-les doucement sur la pile de préparation.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH des tampons de fonctionnement et de transfert car ils doivent être au pH optimal requis. Aussi, il est conseillé de préparer ces tampons et de les conserver à température ambiante avant l’expérience pour gagner du temps.
7. Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre : électrode négative (cadre/extrémité noir) - mousse sandwich - papier filtre - gel SDS-PAGE rincé - membrane nitrocellulosique rincée - papier filtre - mousse sandwich - électrode positive (cadre rouge). Empilez le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et faites-le fonctionner à 90 V pendant 90 min ou à 30 V pendant 360 min.

5. Coloration des anticorps et développement de l’image

1. Retirez la membrane et laissez-la sécher. Bloquer la membrane pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un tampon bloquant composé de 5 % de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaire^8,15,19 et de bêta-actine (contrôle de la charge) dans un tampon bloquant pendant 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C. Laver la membrane en trois lavages de 1x TBS-T pendant 5 min chacun.
   REMARQUE : L’incubation de la membrane séparée avec des contrôles de charge tels que la bêta-actine, l’alpha-tubuline ou les anticorps anti-glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase doit normaliser les autres résultats de western blot lors de la quantification ultérieure. La dilution recommandée pour chaque anticorps primaire est disponible dans le manuel du fabricant.
3. Incuber la membrane lavée avec l’anticorps secondaire dilué 5000 fois dans un tampon de blocage pendant 60 min à température ambiante. Encore une fois, lavez la membrane 3x dans 1x TBS-T pendant 5 min chacune.
   NOTE : Il est fortement recommandé que l’anticorps secondaire soit élevé contre l’espèce chez laquelle l’anticorps primaire est élevé. Par exemple, si l’anticorps primaire de la KCC2 totale est anti-KCC2 de souris, l’anticorps secondaire anti-souris doit être utilisé.
4. Placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Mélangez des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et étalez doucement la solution mélangée sur la membrane pour développer des signaux.

6. Acquisition d’images à l’aide d’un système d’imagerie et quantification des données

1. Transférez la carte d’imagerie dans le compartiment approprié du système d’imagerie pour l’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie sur l’ordinateur pour le traitement d’image.
2. Dans la barre d’outils, cliquez sur Nouveau protocole et choisissez Single Channel. Cliquez sur Sélectionnez dans la boîte de dialogue d’imagerie/application de gel, faites défiler jusqu’à Blot et sélectionnez Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Cliquez ensuite sur Signal Accumulation Setup pour définir la durée et le nombre d’images à acquérir.
3. Cliquez sur Positionnez le gel sous la configuration du protocole et ajustez le gel dans le système d’imagerie si nécessaire. Cliquez sur Exécutez le protocole pour acquérir les images.
4. Faites un clic droit sur l’une des images acquises sous la boîte du catalogue d’imagerie pour enregistrer les images sur l’ordinateur. Naviguez jusqu’à l’image souhaitée et cliquez sur Sélectionnez Image et Continuer dans la boîte de dialogue Exécuter.
5. Cliquez sur l’icône Image Transform pour ajuster le contraste et la saturation en pixels de l’image. Cliquez sur l’icône Capture d’écran dans la barre d’outils générale pour enregistrer l’image sur l’ordinateur en fonction du format d’image souhaité.
6. Mesurez les densités de bandes à l’aide du logiciel ImageJ et analysez-les à l’aide d’outils statistiques appropriés.

Résultats

Tableau 1 : Recette pour faire un mélange de gel de polyacrylamide (séparation et empilement de solutions de gel).

Matériaux