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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Quantification des somas de cellules ganglionnaires rétiniennes
REMARQUE : La procédure suivante est pour la quantification des somas RGC, basée sur la coloration immunohistochimique des supports plats rétiniens avec un anticorps contre la protéine 3A du domaine homéobox/POU spécifique au cerveau (Brn3a).
- Transférez les rétines isolées dans une plaque de culture à 24 puits (une rétine par puits) contenant 1 ml de 1x PBS et maintenez la rétine interne vers le haut.
- Perméabiliser les tissus en les lavant 3 fois pendant 10 minutes avec un tensioactif non ionique à 0,5 % dilué dans 1 PBS (0,3 mL). Ensuite, maintenez le tissu en l’agitant doucement dans de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans un tensioactif non ionique à 2 % et 1x PBS (solution bloquante ; 0,25 ml) pendant 60 min à température ambiante.
- Au cours de l’étape 1.2, préparez la solution primaire d’anticorps Brn3a en diluant 1:200 dans un tensioactif non ionique à 0,5 % et 1x PBS plus 5 % de BSA, et conservez-la à 4 °C.
- Après 60 min de blocage tissulaire, incubez les rétines dans 0,2 ml de solution d’anticorps primaires à 4 °C pendant 72 h en agitant doucement.
- Laver le tissu 3 fois pendant 10 minutes avec 1 PBS, puis incuber le tissu pendant 2 h à température ambiante dans 0,2 mL de solution d’anticorps secondaires diluée 1:750 dans 1 x PBS plus 5 % de BSA.
- De plus, incubez le tissu pendant 10 minutes dans une solution de contre-coloration nucléaire pour la coloration des noyaux fluorescents. Concluez l’immunohistochimie par une dernière étape de lavage avec 1x PBS (0,3 mL) répété 3x.
- Transférez les rétines à l’aide de deux petits pinceaux sur des lames de microscope en verre, en maintenant le côté vitré vers le haut. Positionnez le quadrant rétinien dorsal vers le haut sur les lames de microscope. Faites deux autres coupes radiales vers la tête du nerf optique pour délimiter les 3 autres quadrants (nasal, ventral et temporal).
REMARQUE : Les dimensions de coupe ne sont pas fixes. Ils ne doivent pas être trop courts, ce qui nuit à un aplatissement efficace de la rétine sur la lame, et ne doivent pas être trop longs pour atteindre le foramen du nerf optique et séparer complètement le quadrant rétinien délimité du reste du tissu. - Enfin, appliquez 0,2 ml de produit de montage anti-décoloration sur une lamelle en verre et placez-le sur la rétine montée à plat pour une analyse microscopique tissulaire. Pour estimer la densité des CGR, examinez les montures plates sous un microscope confocal à épifluorescence à l’aide d’un objectif 40x/1,3.
- Pour chaque quadrant de la rétine, prenez huit photos : deux de la rétine centrale (~0,9 mm du disque optique), trois du milieu de la rétine (~2,0 mm du disque optique) et trois de la rétine périphérique (~3,7 mm du disque optique), soit un total de 32 photos par rétine. Utilisez le logiciel FIJI pour compter les cellules Brn3a positives et estimer la densité cellulaire moyenne.