Stimulation du système nerveux intracardiaque pour évaluer la susceptibilité à l’arythmie

Résumé

Source : Jungen, C., et al. Impact des neurones intracardiaques sur l’électrophysiologie cardiaque et l’arythmogenèse dans un système de Langendorff ex vivo. J. Vis. Exp. (2018).

La vidéo fait la démonstration d’une technique ex vivo de stimulation du système nerveux intracardiaque afin d’évaluer la susceptibilité du cœur à l’arythmie. À l’aide d’un appareil de perfusion, un cœur de souris isolé est perfusé avec un tampon oxygéné. Le système nerveux intracardiaque est ensuite stimulé à une fréquence élevée pour induire des arythmies.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de l’appareil de Langendorff

REMARQUE : Un système de perfusion de Langendorff disponible dans le commerce est utilisé.

1. Préparez une solution modifiée de Krebs-Henseleit (119 mM de chlorure de sodium, 25 mM de bicarbonate de sodium, 4,6 mM de chlorure de potassium, 1,2 mM de phosphate de potassium monobasique, 1,1 mM de sulfate de magnésium, 2,5 mM de chlorure de calcium, 8,3 mM de glucose et 2 mM de pyruvate de sodium). Pour éviter la précipitation du calcium, ajoutez un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone à la solution de perfusion. Filtrez le tampon avec une taille de pores de 0,22 μm.
2. Ajoutez un agent pharmacologique au tampon pour étudier son effet sur l’électrophysiologie cardiaque et l’arythmogenèse si nécessaire.
3. Commencez le bain-marie et placez-y la solution de perfusion contenant un mélange de 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Ajustez la température du bain-marie, de sorte que la température de la solution de perfusion directement avant la canule soit de ~37 °C.
4. Dès que la bonne température est atteinte, démarrez la pompe à rouleaux et remplissez l’appareil avec la solution de perfusion.
5. Ajustez le débit de la pompe avant de fixer le cœur, de sorte qu’il ne reste pas de bulles d’air dans la canule lors de son montage sur l’appareil.

2. Préparation matérielle et logicielle

1. Connectez un système d’acquisition de données numériques et son logiciel correspondant à l’appareil Langendorff pour un enregistrement continu de la pression de perfusion, du débit et de la fréquence cardiaque.
   1. Réglez la pression de perfusion ciblée dans les paramètres généraux sur 80 mmHg.
   2. Démarrez l’enregistrement.
2. Pour l’enregistrement des données et la stimulation à l’aide d’un générateur de stimulus numérique désigné, utilisez un cathéter d’électrophysiologie avec des électrodes en platine, une surface d’électrode de 0,5 x 0,5 mm et un espacement des électrodes de 0,5 mm.
   1. Placez le cathéter près de la zone où le cœur sera positionné après la fixation à l’appareil.
   2. Préparez la stimulation en sélectionnant 2 électrodes dans le cathéter et utilisez une durée de cycle de 100 ms.

3. Préparation du cœur

1. Ajouter le tampon de perfusion froid (~2 - 4 °C) (10 - 20 mL et 40 - 50 mL, de sorte que toute la boîte soit couverte) dans les 2 boîtes de Pétri (diamètres de 6 cm et 10 cm) et la boîte avec la canule, et placez-les sur de la glace directement à côté et sous le microscope. Préparez un double nœud autour de la canule.
2. Excise rapidement le cœur après une luxation cervicale en ouvrant le thorax à l’aide de ciseaux Mayo et de pinces à motif étroit. Ensuite, saisissez l’aorte et la veine cave au-dessus du diaphragme à l’aide de la pince de Londres et excisez le bloc cœur-poumon en coupant tous les vaisseaux et le tissu conjonctif près de la colonne vertébrale avec les ciseaux Strabisme.
3. Transférez le bloc cœur-poumon dans le premier plat (6 cm de diamètre) rempli de tampon glacé et retirez soigneusement les poumons sans endommager le cœur à l’aide de ciseaux Strabisme et de pinces London. Ensuite, placez le cœur sous le microscope et retirez soigneusement le thymus, l’œsophage et la trachée à l’aide de ciseaux à ressort et d’une pince Dumont SS.
4. Utilisez les ciseaux à ressort pour percer un trou de 1,5 à 2 mm dans la partie supérieure de l’oreillette droite pour l’insertion du cathéter. Faites un trou dans l’artère pulmonaire. Ensuite, coupez l’aorte directement sous les branches supra-aortiques et retirez le tissu afin que le nœud puisse être fixé facilement.
5. Gardez intacts les coussinets adipeux auriculaires, y compris le plexi ganglionnaire majeur situé atriellement, autour de l’oreillette gauche ou retirez-les complètement par une dissection soigneuse.
6. Transférez le cœur dans la boîte à l’aide de la canule et placez-le sous le microscope. Tirez l’aorte sur la canule à l’aide de la pince Dumont SS et faites fermement le nœud préparé autour de l’aorte. Assurez-vous que la canule n’est pas placée trop profondément dans l’aorte afin que la valve aortique et les vaisseaux coronaires soient laissés libres.
7. Fixez rapidement la canule à l’appareil de Langendorff. Assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles dans la canule.
8. Réglez la pression de perfusion à 80 mmHg, ce qui permet une perfusion à pression constante.
9. Insérez soigneusement le cathéter dans l’oreillette droite et le ventricule droit sans toucher ni endommager le cœur, et fixez-le à la canule avec du ruban adhésif.
10. Démarrez la stimulation avec la durée de cycle préparée de 100 ms pour une période d’équilibre initiale de 20 minutes.
11. Fermez la chambre pour permettre une température stable.

4. Paramètres électrophysiologiques et arythmogenèse

1. Appliquez une stimulation programmée via les électrodes distales ou proximales du cathéter à deux fois le seuil de stimulation auriculaire ou ventriculaire pour évaluer les paramètres électrophysiologiques, comme décrit dans les étapes suivantes.
   1. Déterminez le temps de récupération du nœud sinusal comme la durée maximale du cycle de retour après 10 s de stimulation à débit fixe à une durée de cycle S1S1 de 120 ms, 100 ms et 80 ms.
   2. Déterminez le point de Wenckebach comme la durée de cycle S1S1 la plus longue (8 stimuli ; S1S1 : 100 ms ; réduction progressive de 2 ms) avec une perte de 11 conduction ganglionnaire AV. Déterminer les périodes réfractaires ganglionnaires auriculo-ventriculaires comme étant les plus longues S1S2 (12 stimuli ; S1S1 : 120 ms, 110 ms et 100 ms ; un extrastimulus couplé court avec une réduction progressive de 2 ms de S1S2) avec une perte de conduction nodale AV.
   3. Déterminer les périodes réfractaires auriculaires et ventriculaires comme étant les plus longues S1S2 (12 stimuli ; S1S1 : 120 ms, 110 ms et 100 ms ; un extrastimulus couplé court avec une réduction progressive de 2 ms de S1S2) avec une réponse auriculaire ou ventriculaire absente.
2. Effectuez une extrastimulation programmée (S1S1 : 120 ms, 100 ms et 80 ms, suivie d’un maximum de 3 battements supplémentaires ; 60 à 20 ms avec une réduction par paliers de 2 ms) ou des protocoles de stimulation en rafale (5 s à S1S1 : 50 à 10 ms avec une réduction par paliers de 10 ms) conformément aux conventions de Lambeth pour évaluer l’arythmogenèse ventriculaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S3014	Solution Krebs-Henleit modifiée
Sigma-Aldrich	401676	Solution Krebs-Henleit modifiée
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P5405	Solution Krebs-Henleit modifiée
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	Solution Krebs-Henleit modifiée
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma-Aldrich	M1880	Solution Krebs-Henleit modifiée
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma-Aldrich	C7902	Solution Krebs-Henleit modifiée
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	Solution Krebs-Henleit modifiée
Pyruvate de sodium bioXtra	Sigma-Aldrich	P8574	Solution Krebs-Henleit modifiée
Carbogen (95 % d’oxygène / 5 % de dioxyde de carbone)	SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Allemagne		solution Krebs-Henleit modifiée
EMD Millipore	SCGPT05RE	solution Krebs-Henleit modifiée
Système de perfusion	HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Allemagne	73-4343	Langendorff apparatus
Système d’acquisition de données et logiciel correspondant pour cathéter et paramètre physiologique	Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand	PL3508 PowerLab 8/35	Configuration de Langendorff
Cathéter octapolaire	souris CIB’ER, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA	personnalisé	Configuration de Langendorff
Générateur de stimulus	STG4002, Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne	STG4002-160μA	Configuration de la stimulation
Logiciel de stimulation	Systèmes multicanaux, Reutlingen, Allemagne	Configuration de la stimulation
Pellicule plastique	Parafilm M, Bemis NA, basé à Neenah, WI, États-Unis		Matériaux consommables
ciseaux à ressort	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	Préparation du cœur
Ciseaux de strabisme	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	Préparation du cœur
Mayo Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	14110-15	Préparation du cœur
Pince Dumont SS	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	11203-25	Préparation du cœur
London Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	11080-02	Préparation du cœur
Pince à motif étroit	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Allemagne	Préparation du cœur

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