Induction d’une lésion cérébrale traumatique légère dans un modèle murin

Résumé

Source : Macheda, T., et. al. Modèle à tête fermée contrôlé électromagnétiquement de lésions cérébrales traumatiques légères chez la souris. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la procédure pour induire une blessure à la tête fermée dans un modèle de souris à l’aide d’un cadre stéréotaxique. L’impact contrôlé reproduit une lésion cérébrale traumatique légère, permettant aux chercheurs d’étudier les effets neurologiques et la récupération en mesurant les réflexes et le comportement après une blessure.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Intervention chirurgicale

1. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille à pointe effilée en résine acétal légère, d’une barre d’occlusion et d’un masque d’anesthésie de souris (voir Figure 1G, H). Le gaz isoflurane est délivré à 2 % à 3 % dans l’air ambiant à 100 à 200 mL/min. Surveillez attentivement la respiration de la souris pour vous assurer de la profondeur de l’anesthésie et ajustez le niveau de gaz au besoin.
2. Appliquez un lubrifiant stérile pour les yeux sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
3. Stérilisez le cuir chevelu avec des tampons de povidone iodé et des tampons d’alcool stériles trois fois.
4. Assurez-vous que la souris est profondément anesthésiée en vérifiant l’absence de réponse par pincement des orteils.
5. Faites une incision médiane d’environ 1 cm entre les yeux et le cou à l’aide d’un scalpel, en exposant le crâne (voir Figure 1I).
6. Laissez le crâne sécher pendant 1 à 2 min.
7. Identifiez bregma (le point d’intersection des sutures coronale et sagittale) et lambda (l’intersection des sutures sagittale et lambdoïde) (voir Figure 1J).
   NOTE : Un atlas du cerveau de souris pourrait être utilisé comme référence.
8. Placez l’appareil de support de tête sous la tête et gonflez le bulbe avec de l’eau jusqu’à ce qu’il appuie contre le bas de la tête de la souris mais ne soulève pas la tête loin de la barre de morsure.
   REMARQUE : Cette étape est essentielle pour réduire les problèmes d’oreille possibles dus au traumatisme crânien fermé (CHI). Tout animal dont l’oreille est endommagée par les barres, entraînant un roulement ou un saignement, doit être éliminé de l’étude et euthanasié.
9. Déplacez l’impacteur en place au-dessus de la tête de l’animal.
10. Déployez l’impacteur en plaçant l’interrupteur à bascule Étendre/Rétracter (sur le boîtier de commande de l’impacteur) sur l’interrupteur Étendre.
    REMARQUE : Assurez-vous de vérifier que l’embout est complètement déployé en tirant sur l’embout.
11. Alignez l’impacteur jusqu’à ce qu’il soit centré sur le bregma (voir Figure 1K).
12. Réinitialisez les coordonnées x et y stéréotaxiques numériques dans le lecteur stéréotaxique à 0 (sur la commande de l’écran tactile)
13. Alignez la sonde sur l’emplacement de l’impact en déplaçant la sonde du bregma vers les coordonnées cibles : médial-latéral = 0,0 mm, antéro-postérieur = −1,6 mm.
14. Fixez le capteur de contact à l’oreille de l’animal.
    1. Abaissez lentement la pointe de la sonde avec la sonde allongée jusqu’à ce que le premier contact avec la surface soit établi. Arrêtez-vous au bip.
    2. Réinitialisez les coordonnées z stéréotaxiques numériques dans le lecteur stéréotaxique sur 0.
15. Inspectez soigneusement si l’extrémité affleure le crâne (plans médio-latéral et antérieur-postérieur).
    REMARQUE : Le positionnement de la pointe de la sonde est l’étape la plus cruciale de ce processus pour prévenir les fractures du crâne et les lésions de l’oreille.
16. Rétractez l’impacteur en plaçant l’interrupteur à bascule sur le boîtier de commande en position de rétraction. La pointe se retire et n’a plus de contact avec la tête de l’animal jusqu’au moment de l’impact.
17. Réglez la profondeur de l’impact en ajustant la profondeur dorsale-ventrale à −1,2 mm.
    REMARQUE : La profondeur de l’impact affecte la gravité de la blessure. La profondeur doit être adaptée à différents âges, poids et souches de souris à la gravité des blessures souhaitée. Il peut être nécessaire d’ajuster ou de réajuster la profondeur au fil du temps pour maintenir une gravité constante des blessures. La sévérité peut être évaluée sur le plan neuropathologique : microglie et astrocytes (immunohistochimie (IHC)) et comportemental : le labyrinthe d’eau du bras radial et le test d’évitement actif.
18. Surveillez attentivement la respiration de la souris pour vous assurer de la profondeur de l’anesthésie et ajustez le niveau de gaz au besoin.
    NOTE : Souvent, le pourcentage de gaz isoflurane doit être abaissé ou coupé pendant 10 à 20 s avant l’impact. Surveillez de près l’accélération légère de la respiration. Si la respiration est trop lente au moment de l’impact, l’animal peut mourir dans les 60 premières secondes suivant l’impact par apnée. Cela peut être évité en ajustant la profondeur de l’anesthésie dans les secondes précédant l’impact.
19. Induisez l’impact en appuyant sur l’interrupteur à bascule droit sur impact. La pointe de la sonde descend à la vitesse affichée, puis reste abaissée pendant le temps de séjour défini et se rétracte.
    REMARQUE : Les souris Sham reçoivent une manipulation identique à celle des souris CHI, mais l’impact n’est pas délivré.
20. Démarrez le chronomètre immédiatement après l’impact du CHI pour enregistrer les temps de redressement (temps de retour de la position latérale à la position couchée) ou démarrez le chronomètre lorsque la souris est retirée du cadre stéréotaxique pour les souris factices. Le temps moyen du réflexe de redressement est de 5 à 15 min.
    REMARQUE : Le temps du réflexe de redressement peut varier en fonction de la tension et de l’âge de la souris.
21. Évaluez les souris pour détecter des fractures du crâne, des hémorragies et une apnée visibles. Excluez de l’étude les souris présentant une fracture du crâne déprimée ou une hémorragie visible.
    REMARQUE : Il existe des niveaux graduels de fractures du crâne. Les animaux présentant des fractures du crâne décompressées, où l’os exerce une pression observable sur le tissu cérébral, sont euthanasiés (CO₂ en premier, et la décapitation est utilisée comme méthode secondaire). Si l’extrémité de l’impacteur est correctement réglée, ces types de fractures du crâne sont extrêmement rares. Si une fracture du crâne se produit, la présentation la plus courante est une petite goutte de sang sur le crâne et une légère rugosité tactile du crâne, souvent le long de la suture reliant l’extrémité postérieure de l’os nasal. Ces souris sont notées comme des fractures possibles du crâne dans les dossiers, mais ne sont normalement pas exclues de l’étude.
22. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique.
23. Fermez le cuir chevelu en agrafant la peau.
    NOTE : Des sutures résorbables ou non résorbables pourraient être utilisées pour fermer le cuir chevelu comme alternative aux agrafes.
24. Appliquez une pommade antibiotique triple avec un applicateur stérile à embout de coton sur l’incision fermée.
25. Remettez la souris dans une cage de maintien propre pour la récupération. La moitié de la cage de récupération est remontée sur un coussin chauffant (réglage bas), ce qui permet de s’éloigner de la chaleur lorsqu’il est éveillé et de maintenir la température de l’animal lorsqu’il est inconscient (voir Figure 1L).
    REMARQUE : La souris est placée sur le côté dans la cage de récupération. Pour éviter la suffocation, placez l’animal dans une cage de récupération sans litière ou sur un mouchoir si la litière se trouve dans la cage.
26. Renvoie l’interrupteur à bascule Étendre/Retirer à la position Center/Off .
    REMARQUE : Le courant continuera à fonctionner si l’interrupteur est laissé en position d’extension ou de rétraction, ce qui fait gonfler le piston. L’impacteur ne sera alors pas fonctionnel tant que le piston n’aura pas refroidi.
27. Retirez l’impacteur de son support et placez-le délicatement sur le sac de glace.
    NOTE : Garder l’impacteur sur une banquise aide à réduire le gonflement potentiel de l’impacteur.
28. Surveillez l’animal jusqu’à ce que le réflexe de redressement se produise et notez le temps jusqu’à ce qu’il se redresse (voir Figure 1M).
    REMARQUE : Le réflexe de redressement est défini comme le moment où la souris revient en position couchée. La cage doit être laissée intacte ; La souris pourrait se redresser si la cage est touchée, déplacée ou exposée à certains bruits.
29. Renvoyez les souris dans leur cage d’origine lorsqu’elles sont éveillées et alertes. Habituellement, dans l’heure qui suit la blessure, les animaux sont pleinement conscients et se déplacent. Ajoutez également de la nourriture humide au fond de la cage.

Résultats

Figure 1 : Étape 1 : Configuration de la zone chirurgicale. (A) Un exemple de la zone chirurgicale et des outils nécessaires pour effectuer une chirurgie CHI (poche de glace pour l’impacteur, cadre stéréotaxique équipé de l’impacteur, boîtier de commande de l’impacteur et outils chirurgicaux) est présenté. (B) Une vue rapprochée de l’extré...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
9 mm Applier	Braintree scientific	ACS- APL	Surgery
9 mm Autoclip Remover	Braintree scientific	ACS- RMV	Chirurgie
9 mm Autoclip, Caisse de 1 000 clips	Braintree scientific	ACS- CS	Chirurgie (Agrafes)
logiciel Aperio ImageScope	Leica BioSystems	NA	IHC
BladeFLASK Blade Remover	Fisher Scientific	22-444-275	Chirurgie
Applicateur d’embout en coton	VWR	89031-270	Chirurgie
Digitial mouse stereotaxic frame	Stoelting	51730D	Chirurgie
Dumont #7 Forceps	Roboz	RS-5047	Chirurgie
Barres d’oreilles	Stoelting	51649	Chirurgie
EthoVision XT 11.0	Noldus Information Technology	NA	RAWM
Fiber-Lite	Dolan-Jeffer Industries	UN16103-DG	Chirurgie
Ampoule Fisherbrand pour petites pipets	Fisher Scientific	03-448-21	Appareil
Système d’évitement Gemini	San Diego Instruments	NA	Évitement
Coussin chauffant	Sunbeam	732500000U	Préparation
HRP chèvre conjuguée anti-lapin IgG	Jackson Immuno Research laboratories	111-065-144	IHC
Chambre d’induction	Kent Scientific	VetFlo-0530XS	Préparation
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC : 11695-6777-2	Chirurgie
Tête d’anesthésie au gaz de souris holder	Stoelting	51609M	Chirurgie
Neuropactor Stereotaxic Impactor	Neuroscience Tools	n/a	Surgery : Formellement distribué par Lecia en tant qu’impact one
NexGen Mouse 500	Allentown	n/a	Post-chirurgie, cage
Parafilm	Bemis	PM992	Appareil
Peanut - Tondeuse à cheveux professionnelle	Whal	8655-200	Préparation
Solution de povidone-iode USP, 10 % (p/v), 1 % (p/v) disponible Iode, pour laboratoire<	3955-16	Chirurgie
Pommade vétérinaire Puralube,pommade ophtalmique à la vaseline, lubrifiant oculaire stérile	Dechra	17033-211-38	Chirurgie
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	IHC
Rabbit anti-IBA1	Wako	019-19741	IHC
Labyrinthe d’eau à bras radial à 8 bras	MazeEngineers	n/a	RAWM
Échelle	OHAUS CS series	BAL-101	Préparation
Manche de scalpel #7 Solid 6.25"	Roboz	RS-9847	Chirurgie
Tampons de préparation à l’alcool stérile (alcool isopropylique 70 % v/v)	Fisher Brand	22-363-750	Préparation
Système d’anesthésie à faible débit SumnoSuite	Kent Scientific	SS-01	Chirurgie
10 mL seringue Luer-Lok Tip	BD Bard-Parker	302995	Appareil
Timers	Fisher Scientific	6KED8	Chirurgie
Crème anesthésique topique	L.M.X 4	NDC 0496-0882-15	Préparation
Onguent antibiotique triple	Major	NDC 0904-0734-31	Post-chirurgie
Tubulure	MasterFlex	96410-16	Appareil
Vaporisateur système d’anesthésie monocanal	Kent Scientific	VetFlo-1210S	Préparation

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