Analyse de la dynamique calcique et des modifications du potentiel membranaire dans l’endothélium artériolaire d’une souris

Abstract

Source : Hakim, M. A. et al., Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre l’analyse fonctionnelle d’un tube endothélial artériolaire isolé du cerveau d’une souris. Il décrit les étapes de mesure des niveaux de calcium intracellulaire et du potentiel membranaire, à la fois au départ et en réponse à une stimulation pharmacologique.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’éthique animale appropriée comité d’examen.

1. Matériel et équipement

REMARQUE : Voir le Table des matériaux pour tous les réactifs et matériaux requis pour ce protocole. En outre, les manuels et les sites Web associés aux fournisseurs respectifs peuvent également être consultés si nécessaire.

1. Flow chamber
   1. Fixez une chambre de superfusion avec une lamelle en verre sur une plate-forme composée d’aluminium anodisé. Fixez la plate-forme avec la chambre sur une platine de microscope en aluminium.
   2. Placez un micromanipulateur tenant une pipette à épingler à chaque extrémité de la plate-forme sur la platine du microscope en aluminium.
      NOTE : Si nécessaire, utilisez un appareil de platine transférable avec une unité de chambre d’écoulement pour déplacer un tube endothélial sécurisé et isolé d’un appareil de microscope à un autre à des fins d’expérimentation.
2. Microscopes
   1. Configurez l’appareil expérimental en disposant un microscope inversé (objectifs : 4x, 10x, 20x, 40x et 60x) et une platine manuelle en aluminium sur une table d’isolation des vibrations.
3. Intracellular V_m équipement d’enregistrement
   1. Connecte l’électromètre à un headstage compatible. Utilisez des accessoires, tels qu’un générateur de fonctions et un stimulateur, pour les protocoles nécessitant une injection de courant.
   2. Connectez les sorties de l’amplificateur à un système de numérisation de données, à un oscilloscope et à des moniteurs de ligne de base audibles. Fixez l’électrode de bain de référence (granulé Ag/AgCl) près de la sortie de la chambre d’écoulement.
   3. Assemblez un système photométrique avec les composants intégrés d’une interface de système de fluorescence, d’une lampe à arc à haute intensité et d’une alimentation, d’un hypercommutateur, d’un tube photomultiplicateur (ou PMT) et d’une caméra pour mesurer [Ca²⁺]_i dans les cellules endothéliales.
   4. Assemblez un régulateur de température équipé d’un réchauffeur en ligne pour élever et maintenir une température physiologique (37 °C) tout au long de l’expérience.
   5. Assemblez une plate-forme multicanaux connectée à un contrôleur de vanne avec une vanne de régulation de débit en ligne pour contrôler l’administration de solutions aux tubes endothéliales fixés dans la chambre.
4. Micropipettes et électrodes tranchantes
   NOTE : L’expérimentateur aura besoin d’un extracteur de verre électronique et d’une microforge pour préparer l’épinglage Pipettes.
   1. Pour fixer le tube endothélial dans la chambre de superfusion, préparez des pipettes d’épinglage polies à chaud avec une extrémité sphérique émoussée (diamètre extérieur : 50-70 μm) préparées à partir de capillaires en verre borosilicate à paroi mince.
   2. Pour enregistrer le V_m d’une cellule endothéliale, préparez des électrodes tranchantes avec une résistance de pointe de ~150 ± 30 MΩ à partir de capillaires en verre à l’aide de l’extracteur de verre uniquement.

2. Solutions et médicaments

1. Solution saline physiologique (PSS)
   1. Préparez un minimum de 1 L de PSS en utilisant 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM de CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), et 10 mM de glucose.
   2. Préparez les solutions nécessaires manquant de CaCl₂ (zéro Ca²⁺ PSS) pour la dissection des artérioles cérébrales et l’isolation de l’endothélium Tubes.
      NOTE : Préparez tout solutions en H style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>₂O, suivi d’une filtration (0,22 μm). Assurez-vous que le produit final contient un pH de 7,4 avec une osmolalité comprise entre 290 et 300 mOsm.
2. Fura-2 et les agents pharmacologiques
   1. Préparez le stock de Fura-2 AM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO ; 1 mM). Préparez 500 μL de concentration de travail (10 μM) en ajoutant 5 μL de la matière à 495 μL de PSS pour le chargement.
   2. Préparez au moins 50 ml de concentrations de travail d’agents pharmacologiques dans du PSS ou du DMSO, selon le cas.
3. Conducting solution
   1. Préparer 2 M KCl en dissolvant KCl dans le H style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>₂O (7.455 g de KCl dans 50 mL de H₂O). Passez la solution dans une seringue avec un filtre de 0,22 μm avant de remplir les électrodes tranchantes.

3. Utilisation des tubes endothéliales artériolaires pour l’examen de la physiologie cellulaire

NOTE : Des tubes endothéliales artériolaires isolés et sécurisés peuvent être utilisés pour les enregistrements intracellulaires de [Ca²⁺]_i dynamics and V_m en utilisant respectivement la photométrie et l’électrophysiologie à électrode nette, comme illustré précédemment (Graphique 1). [Ca²⁺]_i et V_m peut être mesuré comme des variables expérimentales séparées ou combinées (Figure 1). Cependant, les tubes endothéliales artériolaires sont plus délicats que l’endothélium artériel, et le temps d’expérimentation ne doit pas dépasser 1 h.

1. Mesure de [Ca²⁺]_i
   1. Allumez l’équipement et le logiciel pour [Ca²⁺]_i enregistrements tout en maintenant une superfusion continue à un débit de 5-7 mL/ Min.
   2. Charge le tube endothélial avec le Ca²⁺ colorant Fura-2 AM pendant 30 min à température ambiante. Lavez les cellules avec une solution de superfusion pendant encore 20 à 30 minutes tout en augmentant progressivement la température du bain à 37 °C. Maintenez la température à 37 °C tout au long de l’expérience.
   3. Ajustez manuellement la fenêtre d’imagerie à l’aide d’un logiciel de photométrie pour vous concentrer sur ~20 cellules endothéliales (Figure 1A). En l’absence de lumière, allumez le PMT sur l’interface de fluorescence et commencez l’acquisition de [Ca²⁺]_i en excitant Fura-2 alternativement (≥10 Hz) à 340 nm et 380 nm tout en collectant l’émission de fluorescence à 510 nm. Une fois un enregistrement de base stable de [Ca²⁺]_i est établi, appliquer des agents pharmacologiques (par exemple, récepteur purinergique agonistes) selon l’objectif expérimental (Figure 1B).
2. Mesure de V_m
   1. Allumez l’équipement et le logiciel pour V_m enregistrements et régler le taux d’acquisition des données (≥10 Hz) tout en maintenant une superfusion continue à un débit de 5 à 7 mL/min. Augmentez progressivement la température du bain jusqu’à 37 °C et maintenez-la jusqu’à la fin de l’expérience.
   2. Tirez une électrode pointue à l’aide d’un capillaire en verre borosilicaté, remplissez-la de 2 M de KCl et fixez-la sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le porte-pipette fixé à un électromètre qui, à son tour, est tenu par un micromanipulateur.
   3. Pendant que vous regardez à travers l’objectif 4x, utilisez un micromanipulateur pour positionner soigneusement la pointe de l’électrode pointue juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial artériolaire dans le PSS qui s’écoule dans la chambre.
   4. Augmentez progressivement le grossissement jusqu’à 400x et repositionnez la pointe de l’électrode si nécessaire.
   5. À l’aide du micromanipulateur, insérez doucement la pointe d’une électrode pointue dans l’une des cellules du tube endothélial et commencez à enregistrer V_m à l’aide d’un électromètre (Figure 1A).

Une fois que l’endothélial au repos V_m est stable (−30 à −40 mV), appliquer le produit pharmacologique souhaité agents par objectif expérimental (Figure 1C).

Results

Figure 1 : Application du tube endothélial pour l’examen physiologique des voies liées à la régulation du flux sanguin.(A) Une électrode pointue (flèche violette) est positionnée dans une cellule d’un tube endothélial focalisé dans la fenêtre d’acquisition de données pour la photométrie. (B) Enregistrement représentatif du Ca²⁺ intracellulaire à l’aide de la ...

Materials