Immunomarquage de protéines membranaires neuronales dans un échantillon de tissu cérébral de souris fracturé par congélation

Résumé

Source : Schönherr, S., et. al. Immunomarquage combiné de l’optogénétique et de la réplique de congélation-fracture pour examiner l’arrangement spécifique à l’entrée des récepteurs du glutamate dans l’amygdale de la souris. J. vis. exp. (2016)

Cette vidéo démontre l’immunomarquage de répliques de tissu cérébral de souris fracturées par congélation pour la microscopie électronique. Les répliques fracturées et enrobées sont digérées pour exposer les récepteurs. Des anticorps primaires et secondaires marqués à l’or sont ajoutés pour marquer des récepteurs membranaires neuronaux spécifiques. La réplique est montée sur une grille et visualisée au microscope électronique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de l’échantillon

1. Fixation cérébrale
   1. Préparation du fixateur
      1. Pour 1 L de fixateur, pesez 10 g de paraformaldéhyde et ajoutez-le à 300 ml d’eau désionisée (H₂O). Chauffer à 55 - 60 ºC pendant ~10 min en remuant continuellement.
      2. Éteignez le feu et ajoutez 7 à 8 gouttes d’hydroxyde de sodium 4 N (NaOH). La solution devrait devenir claire dans ~10 minutes.
      3. Laissez-le refroidir à température ambiante ou RT, ajoutez 150 ml d’une solution saturée d’acide picrique et portez-le à 500 ml avec du H₂O désionisé.
      4. Ajouter 500 ml de tampon phosphate 0,2 M (PB). Filtrer avec du papier filtre. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH.
      5. Refroidissez le fixateur à 6 ºC et conservez-le dans des bouteilles en verre foncé pendant pas plus d’une journée à 6 ºC.
   2. Perfusion transcardiaque
      1. Anesthésie les souris avec une injection intrapéritonéale de thiopental (120 mg/kg de poids corporel). Assurez-vous que l’animal est profondément anesthésié en vérifiant le réflexe de retrait de la pédale, qui doit être absent. Placez l’animal sur le dos sur une table de perfusion avec les quatre extrémités attachées vers le bas.
      2. Ouvrez la paroi abdominale longitudinalement avec des ciseaux à bout émoussé et faites deux coupes supplémentaires latéralement le long du bord caudal de la cage thoracique pour exposer le diaphragme. Coupez le diaphragme et coupez la paroi thoracique au niveau du bord ostéocartilagineux des deux côtés. Soulevez l’extrémité caudale de la plaque centrale de la paroi thoracique contenant le sternum pour exposer le cœur.
      3. Retirez le péricarde et faites une petite incision précise à l’extrémité du ventricule gauche pour admettre la canule de l’appareil de perfusion. Utilisez une canule émoussée d’un diamètre intérieur de 0,6 mm. Passez doucement la canule à travers le ventricule jusqu’à ce que l’extrémité apparaisse dans l’aorte ascendante, et fixez la canule avec une pince. Pour permettre au sang et aux perfusats de sortir de la circulation sanguine, faites une incision dans l’oreillette droite.
      4. Perfuser les souris par voie transcardiale à l’aide d’une pompe péristaltique à un débit de 5 ml/min, d’abord avec une solution saline tampon phosphate ou PBS (25 mM, chlorure de sodium à 0,9 % ou NaCl, pH 7,4) pendant environ 1 min, puis avec un fixateur réfrigéré pendant 7 min.
      5. Après la fixation, coupez la tête de la souris avec une paire de ciseaux, puis coupez la peau à travers la ligne médiane, du cou au nez. Retirez le muscle pour exposer complètement le crâne.
      6. À l’aide de ciseaux tranchants, faites une coupe longitudinale à travers les os occipitaux et interpariétaux en commençant par le foramen magnum. À l’aide d’une pince à épiler fine, retirez ces os pour exposer tout le cervelet. Ensuite, faites une autre coupe longitudinale à travers les os pariétals et frontaux jusqu’à l’os nasal et retirez-les avec une pince à épiler pour exposer tout le cerveau.
      7. À l’aide d’une spatule, retirez le cerveau sans l’endommager et placez-le dans une boîte glacée de 0,1 M PB.
2. Coupe et parage des spécimens
   1. Coupez un bloc coronal d’environ 5 à 6 mm avec des lames de rasoir contenant la zone d’intérêt. Collez-le sur le support du vibroslicer avec une colle cyanoacrylate. Orientez le bloc de tissu de manière à ce que le néocortex fasse face à la lame vibrante. Coupez des coupes coronales contenant l’amygdale à 140 μm avec le vibrosliceur (Figure 1A) dans 0,1 M PB glacé et collectez-les dans une boîte à 6 puits dans le même tampon.
   2. Au stéréomicroscope, coupez la région d’intérêt (ici, l’amas paracapsulaire médio-dorsal des masses cellulaires intercalées de l’amygdale ou ITC ; voir Figure 1B) de la tranche. Faites-le dans une boîte de Pétri recouverte d’élastomère de silicone et remplie de 0,1 M PB, à l’aide d’un scalpel ophtalmique. Assurez-vous que les blocs coupés s’insèrent dans le trou de l’entretoise (environ 1,5 mm) (Figure 1B).
   3. Placez les blocs parés dans une solution de cryoprotection (30 % de glycérol dans 0,1 M PB) pendant la nuit (O/N) à 6 ºC.

2. Congélation à haute pression

REMARQUE : L’immunomarquage par congélation-fracture (FRIL) se compose de 6 étapes essentielles (Figure 2) : 1) Congélation rapide à haute pression (à 2 300 - 2 600 bars) de l’échantillon. 2) Fracturation de l’échantillon. Le plan de fracture suit généralement le noyau hydrophobe central des membranes gelées, les divisant en deux feuillets demi-membranaires : une moitié adjacente au protoplasme (face P) et une moitié adjacente à l’espace extracellulaire ou exoplasmique (face E). 3) Réplication de l’échantillon par dépôt sous vide de platine et de carbone. 4) Digestion détergente des tissus. 5) Marquage Immunogold. 6) Analyse de la réplique à l’aide d’un microscope électronique à transmission.

1. Préparation des supports en cuivre
   REMARQUE : Pour être manipulés à travers les étapes successives de la procédure FRIL, les échantillons doivent être montés sur des supports métalliques (or ou cuivre). La taille et la conception de ces supports varient en fonction du mode de fracturation et du type de machines utilisées. Ici, nous avons utilisé des supports en cuivre (figures 1B, E) et une « double table de réplique » articulée (voir figure 3B), qui, lorsqu’elle est ouverte, produit une rupture de traction à travers l’échantillon gelé (figure 2). Cela permet de conserver et de reproduire les deux côtés de l’échantillon fracturé.
   1. Polissez les supports en cuivre avec un décapant pour ternir à l’aide d’une feuille de peau de chamois.
   2. Placez les supports dans un pot en verre et nettoyez-les deux fois avec un détergent non ionique (pH ~ 1,5) dans un bain d’eau soniquant, puis lavez-les abondamment à l’eau du robinet puis à l’eau déminéralisée, puis rincez deux fois à l’éthanol.
   3. Sonicer les supports de cuivre dans de l’acétone pendant 15 min.
   4. Placez les supports sur du papier filtre pour les faire sécher.
   5. Fixez un anneau de ruban adhésif double face à un support en cuivre (Figure 1C), qui servira de puits de maintien pour le bloc coupé (support de maintien).
2. Congélation de l’échantillon
   REMARQUE : Manipulez l’azote liquide avec soin et portez des lunettes appropriées.
   1. Allumez l’unité de congélation à haute pression (Figure 1F) pendant au moins 1,5 heure avant de congeler l’échantillon.
   2. Démarrez le chauffage en appuyant sur le bouton « AIR HEATER » et faites cuire pendant 50 min. Réglez la température de l’air sur 80 °C.
   3. Connectez le réservoir d’azote à l’unité de congélation à haute pression et appuyez sur le bouton « AZOTE » pour remplir l’intérieur Dewar d’azote liquide. La lampe « NIVEAU D’AZOTE » s’allume. Démarrez le refroidissement en appuyant sur le bouton « Refroidissement ».
   4. Appuyez sur le bouton « DRIVE IN » lorsque le « NIVEAU D’AZOTE » sort. Vérifiez que le système hydraulique déplace le piston d’avant en arrière 3 fois.
   5. Appuyez sur le bouton « AUTO » et le bouton « AZOTE ». Dès que « READY » s’allume, l’unité de congélation à haute pression est prête pour la congélation à haute pression.
   6. Placez un bloc coupé dans le trou du ruban adhésif double face (Figure 1B) à l’aide d’une boucle de fil de platine qui a été fondue dans une pipette en verre.
   7. Retirez l’excès de solution cryoprotectrice à l’aide de papier filtre ou d’un pinceau.
      REMARQUE : Cette procédure est également importante pour éliminer les bulles d’air qui peuvent se former autour du tissu et qui pourraient provoquer une distorsion de la forme du tissu et/ou de l’ultrastructure.
   8. Sous un stéréomicroscope, couvrez le support de maintien avec un autre support, de sorte que le bloc de tissu soit pris en sandwich entre les deux supports.
   9. Insérez le sandwich porteur dans le porte-échantillon de l’unité de congélation à haute pression (Figure 1D). Insérez le porte-échantillon dans l’unité de congélation haute pression (pointe vers le bas) et fixez-le en vissant le porte-échantillon.
   10. Lancez le cycle de congélation en appuyant sur le bouton « Jet-Auto ». En travaillant le plus rapidement possible, retirez le porte-échantillon et immergez la pointe avec de l’azote liquide dans une boîte isotherme. Plongez les pointes de deux paires de pinces dans l’azote liquide pour les refroidir.
   11. Retirez délicatement le sandwich porteur du porte-échantillon et placez-le dans un flacon cryogénique pré-réfrigéré. Assurez-vous que les supports ne sont manipulés qu’avec des pinces refroidies à l’azote liquide. Les flacons cryogéniques doivent être perforés pour permettre à l’azote de s’écouler du flacon (figure 1G).
   12. Répéter les étapes 2.2.6 à 2.2.11 jusqu’à ce que tous les échantillons désirés aient été congelés. Plusieurs sandwichs porteurs contenant le même type d’échantillon peuvent être stockés dans le même flacon.
   13. Conservez les cryoflacons contenant les supports dans un réservoir cryogénique jusqu’à ce qu’ils soient répliqués (Figure 1H).

3. Gel-fracture et réplication

1. Préparation des canons à faisceau d’électrons
   1. Avant d’insérer les canons à faisceau d’électrons, retirez le bouclier avec la « plaque déflectrice ». Placez la « jauge de réglage » pour centrer le filament dans la pince de serrage à travers le couvercle de la cathode inférieure.
      REMARQUE : L’extrémité de plus grand diamètre de la jauge de réglage est utilisée pour le pistolet à carbone, tandis que l’extrémité de plus petit diamètre est pour le pistolet à platine.
   2. Faites glisser le nouveau filament sur le manomètre jusqu’à ce que « les lamelles de pression » puissent serrer les extrémités du filament, en veillant à ce que la bobine de filament ne repose pas en biais.
   3. Retirez la jauge de réglage et insérez la tige de carbone. Fixez-le en serrant la pince de serrage du porte-tige de l’évaporateur, en vous assurant que la hauteur de l’extrémité de la tige se trouve au milieu de la deuxième bobine à partir du bas. Pour le pistolet en platine, la hauteur de l’extrémité de la tige de platine doit être au milieu de la deuxième bobine de filament à partir du haut.
   4. Replacez la plaque déflectrice et insérez les pistolets dans l’unité de congélation-fracture. Nettoyez les pistolets avec une sableuse après utilisation.
2. Configuration de l’unité de congélation-fracture
   1. Activez l’unité de congélation (Figure 3A) en tournant MAINS sur 1. Pour une description détaillée des procédures de gel-fracture et de réplication, voir le mode d’emploi fourni par le fabricant.
   2. Avant de refroidir le dispositif de congélation-fracture, faites cuire l’ensemble du système de refroidissement de l’appareil avec de l’air chaud. Appuyez sur le bouton « Décongélation » de l’appareil MTC 010 (unité de contrôle de la température) (Figure 3A) et laissez le processus de cuisson se dérouler pendant 45 min.
   3. Activez la station d’aspiration. L’unité de congélation-fracture fonctionne généralement dans une plage de vide de ~^10-6 - ^10-7 mbar.
   4. Remplissez le réservoir d’azote et connectez-le à l’unité de congélation. Vérifiez que le support de soupape est sec et nettoyez également l’entrée du réservoir avant d’insérer le support de soupape (l’humidité peut interférer avec le vide et l’indication du remplissage N_°2 du réservoir).
   5. Commencez le refroidissement en réglant la température sur -115 °C. Le refroidissement prend environ 45 min.
   6. Insérez les canons à faisceau d’électrons et ajustez le courant et la tension pour atteindre les paramètres d’évaporation suivants :
      Canon à carbone : rotation activée, position 90°, taux d’accumulation de carbone 0,1 - 0,2 nm/sec
      Canon carbone-platine : rotation désactivée, position 60°, taux d’accumulation 0,06 - 0,1 nm/sec
      REMARQUE : Si un pistolet est utilisé pour la première fois après le remplacement de la tige de carbone ou de platine, Dégazer pendant 3 min avant utilisation.

3. Frification et réplication

   1. Insérez des sandwichs congelés dans une double table de réplique en vous assurant que toutes les manipulations sont effectuées avec de l’azote liquide.
   2. Transférez la table de réplique double dans un récipient Dewar et fixez-la à la réception de l’étage d’échantillon à un angle de 45°. Le niveau d’azote liquide doit toujours être supérieur à la table de double réplique.
   3. Prenez la table à réplique double avec le manipulateur de table et insérez-la dans l’unité de congélation-fracture sur la platine froide. Attendez environ 20 minutes pour permettre à la température de la table de réplique double de s’ajuster à -115 °C.
   4. Vérifiez que le vide est inférieur à ^10-6 mbar et que la température est de -115 °C.
   5. Casser le tissu par rotation manuelle dans le sens inverse des aiguilles d’une montre de la roue reliée au carénage placé au-dessus de la table de réplique double. Lorsque le linceul tourne, il force l’ouverture de la double réplique de la table, fracturant ainsi les tissus.
   6. Appuyez sur le bouton « Haute tension » de l’appareil EVM 030 (unité de contrôle de l’évaporation par faisceau d’électrons) de l’unité de congélation-fracture (Figure 3A).
   7. Reproduire les surfaces exposées du tissu fracturé (figure 3C) par évaporation du carbone (rotation) au moyen d’un canon à faisceau d’électrons positionné à un angle de 90° sur une épaisseur de 5 nm, suivi d’un ombrage unidirectionnel avec du platine-carbone à un angle de 60° sur une épaisseur de 2 nm. Enfin, appliquez une couche de carbone de 15 nm d’épaisseur à un angle de 90° (en rotation).
   8. Utilisez les paramètres suivants pour l’évaporation :
      1er carbone : rotation activée, position 90° ; vitesse 0,1 - 0,2 nm/s ; 5 nm
      2e carbone-platine : position 60° ; vitesse 0,06 - 0,1 nm/s ; 2 nm
      3e carbone : rotation activée, position 90° ; vitesse 0,3 - 0,5 nm/s ; 15 nm
   9. Retirez les échantillons répliqués de l’unité de congélation-fracture et transférez-les sur une plaque en céramique à 12 puits (Figure 4A) remplie de TBS ( Saline tamponnée au tris, pH 7,4).
   10. À l’aide d’un fil machine à boucle de platine, retirez le tissu répliqué du support d’échantillon (figure 4A).
   11. Répétez les étapes 3.3.1 à 3.3.10 jusqu’à ce que tous les échantillons aient été répliqués.

   4. SDS-digestion de la réplique

   1. Transférez la réplique dans un flacon en verre de 4 ml rempli de 1 ml de tampon de digestion SDS (2,5 % de laurylsulfate de sodium, 20 % de saccharose dans 15 mM Tris, pH 8,3). Digérer pendant 18 h à 80 °C en secouant (45 coups/min).
   2. Transférez les répliques dans un nouveau tube rempli de tampon de digestion SDS et stockez-les à RT.

4. Immunomarquage

REMARQUE : Toutes les incubations sont effectuées à RT avec une légère agitation, à l’exception des incubations avec des anticorps.

1. Lavez la réplique pendant 10 minutes dans un tampon de digestion frais de dodécylsulfate de sodium (SDS).
2. Lavez la réplique une fois avec 2,5 % de BSA (albumine sérique bovine) dans une solution saline tamponnée Tris ou TBS pendant 5 min, puis 3 x 10 min avec 0,1 % de BSA dans TBS.
3. Blocage des sites de liaison non spécifiques dans TBS avec 5 % de BSA pendant 1 h.
4. Appliquer des anticorps primaires dilués dans 2 % de BSA-TBS. Effectuer les incubations dans une goutte de 30 μl (figure 4B) dans une chambre humide à 15 °C pendant 72 heures (figure 4C).
   1. Pour cette étude, traitez les deux répliques du tissu fracturé. Incuber une réplique avec un anticorps polyclonal de cobaye élevé contre les acides aminés 717 à 754 de la souris GluR1 communs à toutes les sous-unités du récepteur de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique ou AMPA-R (dilution : 1:200) ou un anticorps monoclonal de souris élevé contre une protéine de fusion recombinante couvrant les acides aminés 660 à 811 de la sous-unité NR1 du récepteur N-méthyl-D-aspartate ou NMDA-R (dilution : 1:500), et un anticorps polyclonal de lapin élevé contre la protéine fluorescente verte (dilution : 1:300).
   2. Incuber l’autre réplique avec un anticorps polyclonal de lapin élevé contre un peptide synthétique correspondant aux acides aminés 384 - 398 du récepteur μ-opioïde du rat (dilution : 1:500).
5. Laver à la cuillère à soupe avec 0,05 % de BSA (3 x 5 min).
6. Appliquez des anticorps secondaires. Pour cette étude, utilisez des anticorps conjugués à l’or (5 nm pour les récepteurs ionotropiques du glutamate, 10 pour les récepteurs μ-opioïdes et/ou 15 nm pour la protéine fluorescente jaune de la channelrhodopsine-2 ou ChR2-YFP) dilués dans du TBS avec 2 % de BSA. Diluer les anticorps secondaires à 1:30 et les incuber en gouttes de 30 μl à 15 °C O/N.
7. Lavage 3 x 5 min à 0,05 % BSA-TBS à RT.
8. Laver 2 x 5 min dans de l’eau ultra-pure.
9. Montez la réplique sur une grille de barres parallèles à 100 lignes revêtue d’un formvar (Figure 4D).

Résultats

Graphique 1. Préparation des tissus et congélation à haute pression. (A) Le vibrotrancheur est utilisé pour sectionner le tissu. (B) Une section de cerveau de souris coronale résultante contenant l’amygdale...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Préparation
Paraformaldehyde EM grade	Agar Scientific Ltd., Royaume-Uni	AGR1018
Solution saturée d’acide picrique	Sigma-Aldrich, États-Unis	P6744-1GA
Na2HPO4-2H20	Merck Millipore, Allemagne	1065860500
NaH2PO4-2H2O	Merck Millipore, Allemagne	1063451000
NaCl	Merck Millipore, Allemagne	1064041000
4N NaOH	Carl Roth, Allemagne<
Thiopental	Sandoz, Autriche	Sigma-Aldrich, USA style='largeur :153pt ;'>G5516-500ML
Système d’eau ultra-pure GenPure	Thermo Fisher Scientific, USA	50131235
Pompe péristaltique	ISMATEC, Allemagne	ISM 930C
Papier filtre	MACHEREY-NAGEL, Allemagne	MN 615 1/4
Vibroslicer, VT1000S	Leica Microsystems, Autriche
Scalpel ophtalmique	Alcon Laboratories, États-Unis
Canule de perfusion	Vieweg, Allemagne	F560088-1
Congélation
Supports en cuivre	Bureau d’ingénierie M. Wohlwend, CH	528
Sidol Polish	Henkel, Allemagne
Peau de chamois	Magasin de fournitures ménagères
Perforatrice, 1,5mm	Stubai, Autriche
Denatured ethanol	Donauchem, Autriche
Acetone	Roth, Allemagne	9372.5
Machine de congélation haute pression HPM 010	BalTec, CH ; maintenant Leica Microsystems	HPM010
Stereo-microscope	Olympus, Japon	SZX10
Azote liquide
Cryo-flacons	Roth, Allemagne	E309.1
CryoCane	Nalge Nunc International,USA	5015-0001
CryoSleeve	Nalge Nunc International,USA	5016-0001
Réservoir de stockage d’azote liquide	Cryopal, France	GT38
Détergent non ionique (Lavocid)	Werner & Mertz Professional, Allemagne
Freeze-fracture and Replication
Sandblaster, Mikromat 200-1	JOKE Joisten & Kettenbaum, Allemagne	SANDURET 2- K
Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21μ	JOKE Joisten & Kettenbaum, Germany	955932
Freeze Fracture System BAF 060	BalTec, CH ; now Leica Microsystems	BAF060
Ceramic 12 well plate	Gröpel, Autriche	14511
Trizma base	SIGMA, USA	T1503
Chlorhydrate de Trizma	SIGMA, USA	T3253
Chlorure de sodium	Merck, Allemagne	1,06,40,41,000
SDS, Sodium lauryl sulfate	Roth, Allemagne	5136.1
Sucrose	Merck, Allemagne	1,07,68,71,000
TRIS	Roth, Allemagne	5429.3
Universal Hybridization Oven	Binder, Allemagne	7001-0050
Immunolabelling
BSA	SIGMA, USA	A9647
Anti-GFP Antibody	Molecular Targets, USA	A11122
Anti-pan-AMPAR Antibody	Frontier Institute, Japan	pan AMPAR-GP-Af580-1
Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1	Merck Millipore, Allemagne	MAB363
Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody	ImmunoStar, USA	24216
EM chèvre anti-cobaye, 5nm ; anticorps secondaire	BBInternational,	EM. GAG5
EM chèvre anti-lapin, 15nm ; anticorps secondaire	BBInternational,	EM. GAR15
Donkey anti-lapin, 10nm, anticorps secondaire	AURION, Pays-Bas	DAR 10nm
Grilles en cuivre, 100 Parallel Bar<	G2012C
Incubator	Major Science, États-Unis	MO-RC
Pioloform Powder	Agar scientific, Royaume-Uni<
Chloroform	Roth, Allemagne	3313.1

des tissustd style='largeur :153pt ;'>T198.1 haute pressiontd style='width :164pt ;'>Agar scientific, UKtd style='largeur :153pt ;'>R1275