Enregistrement simultané de pléthysmographie et d’électromyographie dans un modèle de souris SLA

Résumé

Source : Jensen, V. N., et al. Mesure répétée de l’activité des muscles respiratoires et de la ventilation dans des modèles murins de maladies neuromusculaires. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre la méthode d’enregistrement simultané de signaux de pléthysmographie et d’électromyographie dans un modèle de souris SLA en mouvement libre. La procédure consiste à utiliser des électrodes implantées et un émetteur pour capturer l’activité musculaire, ainsi qu’une chambre de pléthysmographie pour surveiller les schémas respiratoires, afin d’étudier le rôle des muscles accessoires chez la souris SLA.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la souris pour la chirurgie

1. Choisissez la souris souhaitée pour l’implantation (c’est-à-dire SOD1(G93A) ou contrôle) et pesez l’animal.
   REMARQUE : L’âge et le poids recommandés pour une souris (mâle ou femelle) subissant cette chirurgie sont respectivement de P56 - P120 et ≥ 24 g.
2. Anesthésie la souris sous 3,5 % d’isoflurane avec un débit d’oxygène de 2 L/min. Effectuez un pincement des orteils et de la queue pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée.
3. Une fois anesthésié, retirez la souris de la boîte de dépôt et maintenez l’anesthésie via un cône nasal en réglant le niveau d’isoflurane à 1,5 % et le débit d’oxygène à 1 L/min. Effectuez un pincement des orteils et/ou de la queue pour vous assurer que l’anesthésie est maintenue.
4. Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante pour empêcher les yeux de se dessécher pendant l’opération.
5. Rasez la souris pour exposer un site chirurgical entre l’oreille et l’épaule (Figure 1C).
6. Coupez les ongles des orteils de manière ipsilatérale au site chirurgical pour réduire le risque que la souris retire les fils ou cause des blessures en se grattant pendant le processus de guérison.
7. Écouvillonnage alterné du site chirurgical, d’abord avec du désinfectant puis avec de l’isopropanol. Répétez l’opération 2 fois de plus.

2. Implantation du dispositif de télémétrie pour enregistrer l’activité d’électromyographie scalène et trapèze (EMG)

1. Place l’animal sous un microscope de dissection, sur le côté au-dessus d’un coussin stérile recouvrant un coussin chauffant, et fixe le cône nasal en place avec du ruban adhésif. Notez qu’il est préférable d’implanter le côté droit pour réduire le signal de l’électrocardiogramme (ECG) provenant du cœur.
   REMARQUE : Surveillez la respiration et ajustez les niveaux d’isoflurane, si nécessaire, pour maintenir une fréquence respiratoire régulière et un plan d’anesthésie chirurgical approprié.
2. Tire le membre antérieur vers le pied ipsilatéral le long du torse.
   REMARQUE : Cette position déplace l’omoplate vers la queue, offrant un accès chirurgical aux muscles scalène et trapèze.
   1. Prenez la pince incurvée émoussée, maintenez la patte avant ipsilatérale au site chirurgical et fixez la patte avec du ruban adhésif (Figure 1C). Utilisez du ruban chirurgical adhésif puissant pour vous assurer que la patte est bien en place pendant toute la durée de la procédure.
3. Mettez une nouvelle paire de gants chirurgicaux. À l’aide du scalpel, faites une incision oblique d’environ 2 cm de long entre l’épaule et l’oreille (ligne rouge sur la figure 1C).
4. À l’aide de deux pinces à laminectomie #2, une dans chaque main, tirez le coussinet adipeux vers l’arrière et écartez les muscles trapèze et platysma pour exposer le fascia recouvrant les muscles sterno-cléido-mastoïdien et scalène (Figure 1D et E).
5. Utilisez le muscle sterno-cléido-mastoïdien pâle et le nerf phrénique comme repères pour identifier les muscles scalènes. Notez que le nerf phrénique est parallèle aux muscles scalènes, tandis que le sterno-cléidomastoïdien est inférieur. Les muscles scalènes s’étendent obliquement des vertèbres cervicales aux côtes sous le muscle trapèze. Des sondes biopotentielles seront insérées dans le muscle scalène antérieur, qui peut être identifié comme le muscle adjacent au nerf phrénique (figures 1F et G).
   REMARQUE : Attention. Cette zone est très vascularisée, et il faut veiller à ne pas couper l’artère sous-clavière. Évitez d’endommager le nerf phrénique et le plexus brachial.
6. Une fois que les muscles scalènes et trapèzes ont été identifiés (Figure 1G), faites une poche sous-cutanée pour l’émetteur sur le dos de l’animal, entre les omoplates.
   1. Utilisez les ciseaux de séparation des tissus. Insérez les pointes émoussées juste sous la peau et étalez-les jusqu’à ce qu’une ouverture de poche d’environ 1,25 fois la largeur de l’émetteur se forme (Figure 1H).
      REMARQUE : L’émetteur doit être inséré avec une résistance minimale, mais la poche ne doit pas être si grande que l’émetteur puisse se déplacer tout seul. Si la poche est trop petite, l’émetteur pourrait frotter contre la peau, provoquant une irritation qui pourrait inciter l’animal à gratter la peau et/ou à retirer le plomb. Si la poche est trop grande, des séromes pourraient se former, ou l’émetteur pourrait migrer vers une position défavorable.
7. Rincer avec une solution saline chaude et stérile et insérer l’émetteur avec le côté le plus plat contre le muscle. Positionnez l’émetteur de manière à ce qu’il repose à plat et que les fils sortent de la poche, parallèlement les uns aux autres plutôt que tordus (Figure 1I). Enroulez toute longueur de fil excédentaire sous l’appareil et posez-le à plat.
8. Fais passer les fils de l’émetteur aux muscles scalène et trapèze de sorte que les deux ensembles de fils bipotentiels soient plats et parallèles l’un à l’autre.
9. Utilisez la pince à laminectomie pour séparer le scalène antérieur des muscles environnants et insérez une aiguille de calibre 25 perpendiculaire aux fibres musculaires à travers le muscle scalène.
   1. Insérez une sonde dans la pointe de l’aiguille puis retirez l’aiguille du muscle, en laissant derrière elle la sonde insérée dans le muscle jusqu’à l’isolation du fil (Figure 1J et K). Notez quelles sondes colorées sont insérées dans quel muscle.
10. Placez une petite goutte d’adhésif cyanoacrylate sur l’extrémité exposée du fil, près du muscle où le fil est inséré, et faites glisser rapidement le capuchon de plomb sur le fil de sorte qu’aucun fil ne soit exposé entre le capuchon de plomb et le muscle (Figure 2A et B).
    REMARQUE : Bien qu’il soit d’usage de fixer les sondes EMG avec du cyanoacrylate, une méthode alternative consiste à faire un nœud de suture en soie autour du capuchon de plomb.
11. Coupez l’excédent de fil distal au capuchon et appliquez une goutte d’adhésif cyanoacrylate à l’extrémité du capuchon/fil de plomb. Laissez le temps à la colle de polymériser avant de la libérer (figures 2C et D).
12. Suivez les mêmes étapes (étapes 3.10-3.12) pour insérer la sonde de polarité opposée parallèle à la première dans le même muscle, à 1 - 2 mm de la première sonde.
13. Répétez les étapes 3.10 à 3.12 pour insérer des fils dans le muscle trapèze, qui est situé juste en avant du muscle scalène (Figures 1L et M).
14. Assurez-vous que les fils conducteurs sont fixés en place et qu’il y a juste assez de mou pour que l’animal puisse effectuer des mouvements corporels sans tirer dessus. Assurez-vous que toute longueur excessive de plomb ne pousse pas contre la peau, car cela pourrait provoquer une irritation qui pourrait inciter l’animal à gratter ou à retirer la laisse. Repositionnez les fils, si nécessaire, pour éviter toute gêne potentielle.
15. Retirez délicatement le ruban adhésif qui maintient le membre antérieur. Tirez le coussinet adipeux sur le muscle et utilisez-le pour couvrir les fils insérés. Fermez l’incision avec un adhésif cyanoacrylate en rapprochant les rabats cutanés de manière à ce que l’incision s’aligne. Pincez une partie des rabats de peau avec la pince incurvée et appliquez une petite ligne d’adhésif cyanoacrylate le long de cette ligne.
16. Injectez 0,1 mL de carprofène par voie sous-cutanée pour soulager la douleur postopératoire pendant que l’animal est encore sous anesthésie.
    REMARQUE : Continuez à administrer 0,1 mL de carprofène une fois par jour pendant 1 à 2 jours après l’opération, puis au besoin par la suite.
17. Retirez l’animal du cône de nez et placez-le dans une cage propre dans l’incubateur préchauffé jusqu’à ce qu’il soit réveillé et qu’il se déplace volontairement dans la cage. Ensuite, gardez l’animal dans l’incubateur pendant au moins 15 minutes, en surveillant ses mouvements et sa vigilance.

3. Soins postopératoires

1. Hébergez les animaux séparément après l’opération. Fournissez aux animaux guérisseurs du gel diététique et une bouteille d’eau.
2. Surveille l’animal pendant les 30 premières minutes après l’opération. Vérifiez l’animal au moins toutes les heures pendant 5 heures après la chirurgie. Dans les jours qui suivent la chirurgie, vérifiez au moins deux fois par jour.
3. Surveillez la nécrose, l’infection le long de l’incision et à l’intérieur de la cavité corporelle contenant l’implant (c’est-à-dire la chaleur, l’enflure et la rougeur), et la formation de sérome.
   REMARQUE : Ces signes se manifestent au cours de la première semaine après l’opération. La figure 1N montre un animal en bonne santé et guéri un mois après l’opération. Bien que les enregistrements EMG puissent être effectués immédiatement après l’implantation, les animaux ont au moins une semaine pour guérir avant d’enregistrer l’EMG et la pléthysmographie, car les signaux ECG peuvent être élevés immédiatement après l’implantation.

4. Acquisition simultanée de signaux

1. d’électromyographie et de pléthysmographieAllume tout l’équipement d’acquisition, y compris le flux de polarisation.
   REMARQUE : Le débit pour les souris est généralement fixé à 1,0 L/min.
2. Calibrez la ou les chambres de pléthysmographie à l’aide d’un débitmètre.
   REMARQUE : Vérifiez périodiquement les chambres de pléthysmographie pour vous assurer que les joints ne sont pas fissurés ou brisés. Pour maintenir leur bon état, enduire les joints en caoutchouc d’un lubrifiant tel que de la graisse sous vide une fois par semaine.
3. Étalonnage de l’émetteur d’entrée tel que spécifié par le fabricant.
4. Place la souris dans la chambre de pléthysmographie pendant au moins 1 h pour l’acclimater avant d’enregistrer l’EMG et la pléthysmographie. En utilisant plusieurs chambres, il est possible d’enregistrer à partir d’une souris pendant que la souris suivante s’acclimate dans une deuxième chambre. N’allumez pas l’émetteur pendant la période d’acclimatation pour économiser la batterie (Figure 1O).
5. Avant l’enregistrement (mais après l’étalonnage), allumez l’émetteur en plaçant un aimant puissant à moins de 1 pouce de l’animal implanté ; une lumière rouge à l’avant du récepteur indiquera quand l’émetteur est allumé.
6. Commence l’acquisition à l’aide du menu déroulant intitulé « Acquisition » et choisis « Démarrer l’acquisition ». Bien que la durée de l’enregistrement puisse varier d’une expérience à l’autre, un enregistrement typique de pléthysmographie et d’EMG dure de 1 à 3 h.
   REMARQUE : L’émetteur a un taux d’échantillonnage intrinsèque de 240 Hz. Une fréquence plus rapide de 500 Hz est réglée dans le logiciel pour interpoler entre les points et fournir une forme d’onde plus fluide. Le filtre passe-bas (qui sert de filtre anti-alias) et le filtre passe-haut dans l’implant spécifient la bande passante de 1 à 50 Hz pour ce dispositif de télémétrie. Les interférences A/C de 60 Hz ne contribuent pas à l’excès de bruit dans le signal EMG, car les implants sont alimentés par batterie et l’animal protège l’implant et les fils des champs électriques. La pléthysmographie, l’EMG et la vidéo sont automatiquement synchronisées en temps réel via un logiciel d’acquisition.
7. Lorsque l’acquisition est terminée, éteignez l’émetteur avec un aimant et retirez l’animal de la chambre.

Résultats

Graphique 1. Implantation d’un dispositif de télémétrie pour mesurer l’EMG des muscles respiratoires. (A) Émetteurs de télémétrie avec deux paires de fils de biopotentiel pour mesurer l’EMG. Les f...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/J	Jackson Laboratory	4435
Chambre de pléthysmographie	Buxco Respiratory Products/ Data Sciences International	601-1425-001
Récepteurs de télémétrie (modèle RPC-1)	Data Sciences International	272-6001-001
Pompe de polarisation (modèle BFL0500)	Data Sciences International	601-2201-001
ACQ-7000 USB	Data Sciences International	PNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange Matrix	Data Sciences International	271-0117-001
New Ponemah Analysis System	Data Sciences International	PNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20	Data Sciences International	PNM-P3P-520
Ponemah Unrestrained Whole Breath Plethysmography analysis package v5.20	Data Sciences International	PNM-URP100W
Configured Ponemah Software System	Data Sciences International	PNM-P3P-CFG
Module d’analyse (URP)	Data Sciences International	PNM-URP100W
Amplificateur universel	Data Sciences International	13-7715-59
Sync Board	Data Sciences International	271-0401-001
Sync Cable	Data Sciences International	274-0030-001
Transducer-Pressure Buxco	Data Sciences International	600-1114-001
Débitmètre	Data Sciences International	600-1260-001
Aimant et radio inclus dans le kit de démarrage F20-EET	Data Sciences International	276-0400-001
Axis P1363 Video Camera	Data Sciences International	275-0201-001
Terg-A-Zyme	Fisher Scientific	50-821-785	Détergent
Actril	Minntech Corporation	78337-000	Stérilisant
Microscope de dissection stéréo (modèle MEB126)	Leica	10-450-508
Humidificateur/incubateur pour nourrissons servocommandé	OHMEDA Ohio Care Plus	6600-0506-803
TL11M2-F20-EET Transmitters style='width :164pt ;'>Data Sciences International	270-0124-001
Dumont #2 Pince à laminectomie - pointes standard/droite/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	Pour manipuler les fils
Dumont #2 Pince à laminectomie - pointes standard/droite/12cm (x2)	Fine Scientific Instruments	11223-20	Pour la chirurgie
Pince à motif étroit - Dentelée/Courbée/12cm	Fine Scientific Instruments	17003-12
Ciseaux à ressort - Coupe difficile/Droit/Tranchant/12,5cm/6mm Tranchant	Fine Scientific Instruments	15124-12
Ciseaux de séparation de tissus - Droit/Émoussé-émoussé/11.5cm	Fine Scientific Instruments	14072-10
Ciseaux fins - Coupe dure/Courbeté/Tranchant-Tranchant/9 cm	Fine Scientific Instruments	14058-11	Pour couper les fils et couper les clous
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Scalpel Blade	Fine Scientific Instruments	10010-00	Pour préparer les capuchons
Suture résorbable tressée Polysorb	Coviden	D4G1532X	Pour enrouler les fils
Gluture	Zoetis Inc.	6606-65-1	Adhésif
3 mL Serion Slip Tip - Soft	Vitality Medical	118030055
25G Needle (X2)	Becton Dickinson and Co.	305-145
Applicateurs à pointe de coton	Henry Schein Animal Health	100-9175
Andis Easy Hair Clipper Set	Andis	049-06-0271	Rasoir électrique vendu chez Target
Isoflurane	Henry Schein Santé animale	29404	Anesthésique
Alcool isopropylique 70 %	Priority Care 1	MS070PC
Dermachlor 2 % Gommage médical ( chlorohexidine 2 %)	Butler Schein	55482
Artificial Tears	Henry Schein Animal Health	48272	Lubricant Opthalmic Ointment
Graisse pour aspirateur	Dow Corning Corporation	1597418
Couverture d’eau	JorVet	JOR784BN

enzymatique chimique de plomb de l’émetteur cyanoacrylate