Ce protocole décrit l’infusion contrôlée de sang autologue dans la région pontique du cerveau d’un rat pour modéliser une hémorragie pontique massive. Le but est de simuler une hémorragie cérébrale localisée en augmentant la pression localisée.
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Article de méthode
Induction d’une hémorragie pontique massive dans un modèle de rat par injection sanguine autologue
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28 avril 2025
Dans cet article
Résumé
Protocole
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
- Animal et instruments
- Utiliser des rats Sprague-Dawley mâles de 8 semaines pesant 250 ± 10 g.
- Hébergez les rats pendant au moins 7 jours avant l’opération dans des conditions environnementales contrôlées avec une température ambiante de 25 °C, une humidité relative de 65 % et un cycle lumière-obscurité de 12/12 h.
- Fournir de la nourriture et de l’eau sans limite.
- Préparez les instruments (Figure 1A-E).
2. Injectez le sang dans le pons
- Pesez à nouveau les rats 3 jours avant l’opération pour sélectionner des rats ayant un poids corporel approprié pour les expériences.
- Pendant les 3 jours avant la modélisation, entraînez les rats à marcher sur la poutre d’équilibre 3 fois par jour pour vous assurer que les rats normaux puissent passer la poutre d’équilibre sans pause.
- Préchauffez le coussin chauffant à 37 °C avant l’anesthésie.
- Fixez une microperceuse au support sur le cadre stéréotaxique.
- Injectez aux rats 50 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale. Attendez qu’il n’y ait plus de réponse par pincement.
- Transportez le rat dans le cadre stéréotaxique en position couchée. Placez les barres auriculaires au-dessus du conduit auditif pour sécuriser la tête. Fixez le crâne en position horizontale pour éviter que l’injection ne soit faussée (Figure 1F).
- Maintenez l’anesthésie par isoflurane (97,5 % d’oxygène et 2,5 % d’isoflurane) à travers un cône de nez stéréotaxique avec un orifice d’entrée et de sortie.
- Utilisez une pommade pour les yeux pour garder la cornée humide.
- Rasez les cheveux au-dessus du crâne avec un micro-rasoir.
- Tracez une ligne médiane de 3 cm avec un marqueur dans le crâne à partir de la ligne du canthus latéral bilatéral jusqu’à 0,5 cm derrière la fontanelle postérieure, comme le montre la figure 1F.
- Appliquez le gommage chirurgical Entoiodine de manière circulaire, en commençant par le milieu de la ligne médiane marquée et en tournant vers l’extérieur.
- Place le champ chirurgical.
- Faites une incision avec un scalpel le long de la ligne médiane marquée.
- Utilisez un coton-tige pour enlever tout sang potentiel.
- Placez un morceau de pince de chaque côté du rabat du cuir chevelu pour exposer le crâne (Figure 1G).
- Trempez un coton-tige dans une solution saline à 0,9 % et retirez délicatement les tissus conjonctifs de l’os du crâne pour éviter que les tissus conjonctifs ne se coincent dans la micro-perceuse.
- Marquez le point central du bregma comme point d’origine à l’aide d’un marqueur.
- Effectuez une craniotomie (1 mm de diamètre) à l’aide d’une micro-perceuse à AP-9.0 mm, Lat 0 mm (Figure 2B et Tableau 1). Procédez avec prudence car ce point est très proche du sinus veineux (Figure 1G).
- Retirez la microperceuse du cadre stéréotaxique.
- Insérez une seringue Hamilton de 100 μL dans le support stéréotaxique (Figure 1K). Allumez l’interrupteur de la pompe d’injection, cliquez sur le bouton d’inhalation rapide, aspirez la solution d’héparine (12500 U diluée dans 100 ml de solution saline) à 100 μL, puis vidangez-la complètement pour éviter que le sang ne coagule trop rapidement.
- Appliquez un gommage chirurgical à la chlorhexidine et à 75 % d’alcool sur toute la queue, de la racine à la pointe, au moins 3 fois pour désinfecter la peau, adoucir l’excitation et dilater la veine de la queue pour augmenter le taux de réussite de l’injection.
- Fixez une acupuncture du cuir chevelu à une seringue de 1 ml.
- Insérez l’acupuncture du cuir chevelu dans une veine latérale de la queue à 3 cm de l’extrémité de la queue et prélevez 150 μL de sang (Figure 1H).
- Retirez l’acupuncture du cuir chevelu de la seringue de 1 ml.
- Transférez le sang dans un tube (Figure 1I).
REMARQUE : Transférez rapidement pour éviter la coagulation du sang. - Change les gants chirurgicaux.
- Choisissez le mode Retrait, réglez le volume sur 100 μL, réglez la vitesse sur 200 μL/min, cliquez sur le bouton RUN et aspirez 100 μL de sang dans la seringue Hamilton (Figure 1J).
- Choisissez le mode Infuse et réglez la vitesse à 1 μL/min.
- Avancez la seringue jusqu’à ce que l’embout atteigne 9,2 mm sous la surface du cerveau (Figure 2C et Figure 1L).
- Cliquez sur le bouton Exécuter pour injecter les premiers 10 μL de sang à une vitesse de 1 μL/min (Tableau 1).
- Arrêtez l’injection et laissez la seringue en position pendant 20 min pour empêcher le sang de circuler dans l’espace sous-arachnoïdien.
- Rétractez la seringue jusqu’à ce que l’embout arrive à 9.0 mm sous la surface du cerveau.
- Redémarrez l’injection à la même vitesse de 1 μL/min jusqu’à ce que le sang résiduel ait été complètement injecté.
- Laissez la seringue en position pendant 10 min pour éviter le reflux sanguin.
- Retirez lentement la seringue du cerveau.
- Utilisez du ciment osseux pour couvrir le trou de craniotomie.
- Lorsque le ciment sèche, suturez la plaie avec un filament de suture en polyamide 4-0. Après avoir cousu 3 ou 4 mailles, faites 2-1-1 nœuds chirurgicaux standard.
- Pour prévenir l’infection, injectez au rat de la pénicilline (0,25 mL, 80 UI diluée dans 4 mL de solution saline) par voie intrapéritonéale.
- Injectez par voie sous-cutanée du tartrate de butorphanol (2,5 mg/kg) et répétez l’injection toutes les 2 heures pour soulager la douleur postopératoire jusqu’à 24 heures après l’opération.
- Observez le rat toutes les 15 min jusqu’à ce qu’il se remette complètement de l’anesthésie. Remettez-le dans la cage d’origine, avec un coussin chauffant sous la cage. Donnez au rat un accès libre à la nourriture et à l’eau jusqu’au sacrifice.
Tableau 1 : Injection de sang autologue.
Mild | Moderate | Massif | |
Volume total | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
Première injection | |||
Coordonnées stéréotaxiques | AP -9.0 mm ; Lat 0 ; Vert -9.2 mm | ||
Volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
vitesse | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
Interval time | 20 min | 20 min | 20 min |
Second injection | < | ||
Coordonnées stéréotaxiques | AP -9.0 mm ; Lat 0 ; Vert -9.2 mm | AP -9.0 mm ; Lat 0 ; Vert -9.0 mm | |
Volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
vitesse | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
Avant le retrait de l’aiguille | 10 min | 10 min | 10 min |
AP : position antéropostérieure | |||
Lat : latéral | |||
Vert : vertical | |||
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Résultats
Figure 1 : Instruments et procédure chirurgicale. (A) Appareil d’anesthésie. (B) Instruments chirurgicaux. (C) Micro-forage. (D) Pompe de micro-injection. (E) Appareil stéréotaxique. (F) Une ligne est marquée au milieu du crâne. (G) La flèche jaune pointe vers l’emplacement de l’exercice. (H) Drainage du sang de la veine de la queu...
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 100ml solution saline | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection de sang | |
| 1ml Seringue | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Prélever du sang autologue de la veine de la queue |
| 75 % d’alcool | Shandong Lierkang | Désinfection de la queue | |
| Ruban adhésif | Shanghai Jinzhong | < | |
| Système d’anesthésie animale | RWD | R510-31S-6 | Inducation et maintien de l’anesthésie |
| Poutre d’équilibre | Jiangsu Saiangsi | Pour les scores de déficit neurologique | |
| Ciment osseux | Shanghai Xinshiji | 20180306 | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | ||
| Perceuse crânienne électrique | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Faire un trou de bavure sur le crâne |
| EP tube | Nantong Surui | < | |
| Crème pour les yeux à l’érythromycine | Pharmacie du Yunnan | ||
| Coussin chauffant | Dangerous Jungle | JR01 | Rester au chaud |
| Héparine sodique injectable | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Préparation du diluant à l’héparine |
| IndoPhors | Guoyao de Chine | < | |
| Isoflurane | RWD< | ||
| Pompe de micro-injection | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection de sang |
| Porte-aiguille | Shanghai Jinzhong | J32020 | Instruments Surgicl |
| Péniciline | Guoyao de Chine | Prévention des | |
| -pourboires | Jiangxi Songhe | Instruments | |
| Aiguille de cuir chevelu | Jiangxi Hongda | 20200313 | Retirer du sang autologue de la veine de la queue |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Instruments |
| Ciseaux de cisaillement | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Appareil stéréotaxique | RWD | 900-00001-00 | Pour le positionnement chirurgical |
| Serviette chirurgicale | Xinxiang Huakangweicai | ||
| 20070601 | |||
| Aiguille de suture | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Ciseaux de suture | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Pince de maintien des tissus | Shanghai Jinzhong | J31080 | Instruments surgicl |
