Immunoprécipitation de la chromatine native des cellules de la neurosphère

Résumé

Source : Mendez, F. M. et al., Immunoprécipitation native de la chromatine à l’aide de neurosphères de tumeurs cérébrales murines. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo démontre l’isolement de complexes protéine-ADN à partir de cellules de la neurosphère dérivées d’une tumeur cérébrale de souris à l’aide de l’immunoprécipitation native de la chromatine. Il détaille les étapes de préparation de la chromatine, d’immunoprécipitation, de lavage et de digestion des protéines afin de libérer l’ADN pour l’analyse en aval.

Protocole

1. Immunoprécipitation de la chromatine native (ChIP)

1. Préparation de la chromatine
   1. Après avoir constitué un stock de cellules neurosphériques dérivées (NS), cultiver la NS dans un flacon T-75 dans 15 mL de milieu NSC à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire avec une atmosphère de 95 % d’air et 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les NS deviennent confluents. Une plaque T-75 confluente produira 3-5 X 10⁶ cellules.
   2. Lorsque les cellules deviennent confluentes, centrifuger le NS à 300 x g pendant 5 min, décanter le surnageant et ajouter 1 mL de milieu de dissociation cellulaire. Incuber les cellules à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 5 mL de milieu et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      REMARQUE : 1 x 10⁶ cellules sont nécessaires par réaction d’immunoprécipitation (IP). Notez qu’un sérum pré-immun ou un contrôle IgG doit également être inclus.
   3. Centrifuger le NS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à 300 x g pendant 5 min, décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille de NS avec 1 mL de solution saline équilibrée et transférer la suspension dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à faible liaison protéique.
   4. Centrifuger le NS à 300 x g pendant 5 min, décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 95 μL de tampon de digestion (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM de CaCl₂, 0,2 % d’éther d’octylphényle de polyéthylène glycol) par 1 x 10⁶ cellules complétées par un cocktail d’inhibiteurs de protéase à une concentration élevée (1:100). Pipetez immédiatement les cellules de haut en bas pour éviter qu’elles ne s’agglutinent et ne créent pas de bulles.
   5. Remettre en suspension la nucléase micrococcique (MNase) dans du glycérol à 50 % pour produire une solution à 1 mg/mL (1,15 unité/μL, stockée à -20 °C) qui sera appelée « 1x » stock. Préparez un stock « 0,1x » en effectuant une deuxième dilution 1:9 avec 50 % de glycérol (e.g., 900 μL de « 1x » MNase et 100 μL de 50 % de glycérol) et stockez-le à -20 °C.
   6. Mélangez 5 μL de MNase « 0,1x » et 145 μL de tampon de digestion. Gardez l’enzyme sur de la glace tout le temps. Ajouter 5 μL de MNase diluée dans le tampon de digestion par 1 x 10⁶ cellules. Agitez le tube pour mélanger et placez le tube dans un bloc à 37 °C pendant exactement 12 min. Traitez les échantillons un par un pour garantir un temps d’incubation précis de 12 min.
   7. Ajouter 10 μL de 10 tampons d’arrêt MNase (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)) par 1 x 10⁶ cellules. À partir de ce moment, les échantillons doivent être conservés sur de la glace.
   8. Ajouter 110 μL de « tampon RIPA (2x tampon de dosage de radioimmunoprécipitation) » (280 mM de NaCl, 1,8 % de polyéthylène glycol octylphényléther, 0,2 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,2 % de Na-désoxycholate, 5 mM d’éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl)-N, N, N, N', acide tétraacétique (EGTA) ; stocké à 4 °C) complété par un cocktail inhibiteur de protéase à haute concentration (1:100) par 1 x 10⁶ cellules. Agitez le tube pour mélanger.
   9. Centrifuger les tubes pendant 15 min dans un microfuge à 4 °C et 1700 x g. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation ordinaire de 1,5 mL (les tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique ne sont plus nécessaires) et stockez-les sur de la glace. Jetez la pastille.
      
2. Immunoprécipitation (IP)
   1. Mélangez des billes magnétiques de protéine A et de protéine G dans un rapport de 1:1. Pour chaque IP, préparez 25 μL de billes.
   2. Laver les billes en ajoutant 1 mL de tampon RIPA (10 mM de Tris pH 8,0, 1 mM d’EDTA, 140 mM de NaCl, 1 % d’éther octylphénylique de polyéthylène glycol, 0,1 % de SDS, 0,1 % de Na-désoxycholate ; stocké à 4 °C) complété par des inhibiteurs de protéase à faible concentration (1:1000).
   3. Utilisez un aimant pour permettre aux billes de se séparer de la solution de lavage et décantez la solution de lavage (environ 1 min). Effectuez l’étape de lavage deux fois.
   4. Remettre les billes en suspension dans leur volume d’origine à l’aide d’un tampon RIPA complété par des inhibiteurs de protéase (1:1000).
   5. Si nécessaire, diluer la chromatine à l’aide d’un tampon RIPA complété par des inhibiteurs de protéase (1:1000) de sorte que chaque IP ait un volume de 100 à 200 μL. Réserver 10 % du volume utilisé par IP de chromatine pour l’entrée.
      NOTE : Par exemple, si 200 μL sont utilisés par IP, 20 μL de chromatine diluée doivent être réservés pour l’entrée. Pour un total de quatre IP, le volume total de chromatine doit être dilué à 820 μL.
   6. Préparez l’entrée. Ajouter 100 μL de tampon TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) complété par la protéinase K (0,5 mg/mL) à l’entrée et incuber l’entrée à 55 °C pendant 1 h.
   7. Purifier l’entrée à l’aide d’une trousse de purification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en suivant les instructions du fabricant et éluer dans 50 μL de tampon d’élution fourni dans la trousse.
   8. Mesurez la concentration de l’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume et enregistrez les résultats dans un carnet. Ébauche avec tampon d’élution du kit.
      REMARQUE : Dans les neurosphères de souris, nous avons utilisé environ 6 μg d’ADN pour chaque IP.
   9. Exécutez une entrée sur un gel à 1 % ou chargez 1 μL sur un bioanalyseur d’ADN à l’aide des paramètres standard. Stockez le reste pour l’utiliser comme entrée dans les applications en aval.
   10. Ajoutez 10 μL de billes magnétiques de protéines A et G lavées pour chaque IP et incubez IP pendant 1 h à 4 °C.
       REMARQUE : Par exemple, ajoutez 30 μL de billes magnétiques de protéines A et G pour trois IP.
   11. Placez les échantillons sur un aimant et laissez les billes se séparer. Divisez la chromatine en transférant la quantité précédemment déterminée dans un nouveau tube de 1,5 ml.
   12. Ajoutez l’anticorps et enveloppez les capuchons d’un film plastique de paraffine pour éviter l’évaporation. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C avec rotation à 20 tr/min.
       REMARQUE : La concentration doit être déterminée empiriquement selon les recommandations du fabricant.
   13. Le lendemain, faites tourner les tubes à l’aide d’une mini-centrifugeuse à température ambiante, 2000 x g, pendant 10 s. Ensuite, ajoutez 10 μL de billes à chaque IP et incubez IP pendant 3 h à 4 °C avec rotation à 20 tr/min.
       
3. IP lavages et digestion des protéines
   1. Ajouter 150 μL de tampon RIPA complété par des inhibiteurs de protéase à faible concentration (1:1000) à chaque IP et incuber IP à 4 °C avec rotation à 20 tr/min pendant 5 min. Placez l’échantillon sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. Utilisez une pipette pour retirer le surnageant. Répétez cette étape cinq fois.
   2. Ajouter 150 μL de tampon de chlorure de lithium (LiCl) (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,5 % Na-désoxycholate ; stocker à 4 °C) complété par des inhibiteurs de protéase à faible concentration (1:1000) à chaque PI et incuber PI à 4 °C avec rotation à 20 tr/min pendant 5 min. Placez l’échantillon sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. Utilisez une pipette pour retirer le surnageant.
   3. Ajouter 150 μL de Tris-EDTA (TE) froid (sans inhibiteur de protéase) et incuber l’échantillon à 4 °C avec rotation à 20 tr/min pendant 5 min. Placez l’échantillon sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. Utilisez une pipette pour retirer le surnageant.
   4. Après l’étape finale de lavage, remettre l’échantillon en suspension dans 100 μL de tampon TE complété par la protéinase K (0,5 mg/mL) et incuber l’échantillon à 55 °C pendant 1 h.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, réfrigéré	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Chlorure de calcium	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciférin, Sel de Potassium	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	pour les lavages de perles magnétiques
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic billes
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	préparer une quantité de 20 μg/mL dans 0,1 % BSA et aliquote.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-acide tétraacétique) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Bovin Serum	Gibco	10437028	pour geler les cellules
FGF	PeproTech	100-18b	Préparez 20 μg/mL de stock dans 0.1 % BSA et aliquote.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	pour la dissection de la tumeur
Glycérol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	anesthésique par inhalation
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Microtubes à faible liaison	Corning Costar	CLS3207	low Tube de microcentrifugeuse de liaison aux protéines
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Nucléase micrococcique	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix<	Chaque lot peut différer ; Achetez une quantité suffisante pour les expériences et l’aliquote.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	agent antimicrobien, à utiliser à 0,1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma-Aldrich	P8340	aliquote et stocker à -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	faire 10 mg/mL de stock dans l’eau ; aliquote et stocker à -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	kit de purification de l’ADN
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	pour la dissection de la tumeur
Chlorure de sodium	VWR	0241-5KG	réactif de tampon
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Mini centrifugeuse standard	Fisherbrand	12-006-901	mini centrifugeuse standard
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	microscope de dissection fluorescente
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

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