Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris

Résumé

Source : Jolly, S., et.al. Combinaison de l’hybridation in situ à double fluorescence avec immunomarquage pour la détection de l’expression de trois gènes dans des sections de cerveau de souris. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo démontre l’utilisation de l’hybridation in situ à double fluorescence pour visualiser l’expression de deux cibles d’ARN dans des coupes de cerveau de souris. Le protocole implique une détection séquentielle de l’ARN à l’aide de sondes marquées à la fluorescéine, à l’isothiocyanate et à la digoxigénine, suivie d’une amplification enzymatique du signal pour améliorer la sensibilité. La fluorescence résultante permet l’analyse de co-localisation des ARN cibles dans le tissu.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Hybridation

1. Préparez un tampon de lavage à 65 °C : 150 mM de NaCl, 15 mM de Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x citrate de sodium salin), 50 % (v/v) formamide et 0,1 % (v/v) Tween-20.
2. Préparez le tampon MABT : 100 mM d’acide maléique, 150 mM de NaCl, 0,1 % (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Diluer les deux sondes (marquées DIG et FITC) 1/1 000 dans un tampon d’hybridation (eau désionisée traitée au DEPC avec 50 % (v/v) de formamide désionisé, 200 mM de NaCl, 5 mM d’EDTA, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 5 mM de NaH₂PO₄, 5 mM de Na₂HPO₄, 0,01 mg/ml d’ARNt de levure, 1× solution de Denhardt et 10 % p/v de sulfate de dextran) préchauffé à 65 °C et bien mélanger.
4. Appliquer environ 300 μl de mélange d’hybridation sur chaque lame, lamelle avec des lamelles cuites au four (200 °C) et incuber O/N à 65 °C dans une chambre humidifiée.
5. Transférez les lames dans un bocal Coplin contenant un tampon de lavage préchauffé. Lavez les lames pendant 30 minutes deux fois à 65 °C avec un tampon de lavage.
6. Lavez les diapositives pendant 10 minutes trois fois avec MABT à RT.

2. Visualisation de la sonde FITC

1. Préparez le tampon de blocage ISH : MABT avec 2 % de réactif de blocage et 10 % de sérum de mouton inactivé par la chaleur.
2. Facultatif : utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des sections de tissu sur la lame afin de réduire le volume de solutions d’anticorps nécessaires.
3. Incuber les lames pendant 1 heure à RT avec un tampon de blocage ISH dans une chambre humidifiée.
4. Incuber les lames O/N à 4 °C avec un anticorps anti-FITC conjugué à la peroxydase de raifort (POD) dilué 1/500 (v/v) dans un tampon bloquant l’ISH.
5. Placez les lames dans un bocal Coplin contenant du PBS avec 0,1 % (v/v) de Tween-20 (PBST). Laver 3 fois pendant 10 minutes dans du PBST et remplacer par du PBST frais à chaque fois.
6. Immédiatement avant l’utilisation, préparez le tyramide fluorescent en le diluant 100 fois dans le diluant d’amplification. Pour cet exemple, utilisez FITC-tyramide.
7. Ajoutez-le aux diapositives et laissez agir 10 min à RT.
8. Placez les diapositives dans un bocal Coplin et lavez-les 3 fois dans PBST pendant 10 min.

3. Visualisation de la sonde DIG

1. Préparez 0,1 m de tris- HCl pH 8,2.
2. Incuber les lames avec un tampon bloquant ISH pendant 1 heure à RT.
3. Incuber les lames O/N à 4 °C avec un anticorps anti-DIG conjugué à la phosphatase alcaline (AP) dilué 1/1 500 (v/v) dans un tampon bloquant ISH.
4. Laver avec du MABT pendant 10 minutes trois fois.
5. Laver deux fois avec 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 pendant 5 min à RT.
6. Immédiatement avant utilisation, préparer la solution Fast Red en dissolvant les pastilles dans 0,1 M Tris pH 8,2. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μM.
7. Incuber les lames à 37 °C avec la solution Fast Red dans une chambre humidifiée. Comme le temps de développement optimal varie, vérifiez régulièrement les lames avec un microscope fluorescent pour surveiller la formation de précipité. Pour cet exemple, arrêtez la réaction après 2 à 3 heures.
8. Laver avec du PBST pendant 10 minutes trois fois.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	pour un tampon de lavage à 65°C
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503		Tween-20
Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146	<
Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Sérum de mouton inactivé par la chaleur	Sigma	S2263
Hydrophobic pen	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-conjugated antibody	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjugué	Roche	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Mount-medium	Dako	S3023
Microscope confocal Leica SP2	Leica	<
Millex	SLGP033RS
Deionized formamide	Sigma	F9037	pour le tampon de blocage ISH
Chlorure de sodium	Sigma	S3014
Acide chlorhydrique	VWR International	20252.29	<
Sigma	S8282
Phosphate de sodium dibasique dihydraté	Sigma	30435<
Yeast tRNA	Roche	10109495001
50x La solution de Denhardt	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Acétate de sodium	Sigma	S2889	<
Sigma	T1503

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