Coloration par immunofluorescence d’un tissu fibrovasculaire malade dérivé d’un patient incorporé dans du gel

Résumé

Source : Gucciardo, E., et. al., Un modèle de culture tissulaire ex vivo pour les complications fibrovasculaires dans la rétinopathie diabétique proliférative. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo détaille un protocole d’immunomarquage pour les cultures ex vivo de tissu fibrovasculaire intégré dans du gel de fibrine. Cela permet une visualisation détaillée des changements vasculaires associés à la rétinopathie diabétique proliférative

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Coloration par immunofluorescence à montage entier

REMARQUE : Ce protocole dure 5 jours et peut être interrompu par des incubations d’une nuit si indiqué. Ne laissez à aucun moment les gels de fibrine sécher. Toutes les étapes sont effectuées chez RT, sauf indication contraire.

1. Préparez les solutions suivantes avant de commencer le protocole de coloration.
   1. Solution post-fixation : préparer une solution 50:50 d’acétone :méthanol en mélangeant des quantités égales d’acétone et de méthanol (par exemple, 50 mL). Conserver à -20 °C. Préparez cette solution au plus tard la veille de la coloration. Cette solution peut être stockée à -20 °C et être utilisée pour les colorations ultérieures.
      REMARQUE : Préparez cette solution dans une hotte car l’acétone et le méthanol sont inflammables et dangereux pour la santé.
   2. Solution bloquante : préparer une solution de sérum de veau fœtal à 15 % (FBS) et à 0,3 % d’éthoxylate d’octylphénol dans du PBS en ajoutant d’abord 15 % de FBS au PBS. Ajouter l’éthoxylate d’octylphénol et remuer pour dissoudre. Conserver à 4 °C.
      REMARQUE : Cette solution peut être préparée en grande quantité à l’avance, stockée dans des aliquotes de 15 mL à -20 °C, et décongelée avant utilisation le jour où le protocole de coloration est commencé. Utilisez des aliquotes fraîchement préparées ou fraîchement décongelées pour chaque protocole de coloration.
   3. Solution de lavage : Préparez 1 L de PBS complété par 0,45 % d’éthoxylate d’octylphénol en ajoutant 4,5 mL d’éthoxylate d’octylphénol à 995,5 mL de PBS. Remuer pour dissoudre. Magasin chez RT.
2. Soulevez soigneusement les gouttelettes de la plaque à l’aide d’une spatule en acier inoxydable à bord carré. Détachez d’abord la gouttelette des bords avant de soulever le centre et transférez-la dans un puits de plaque à 12 puits contenant 1 ml de PBS.
   REMARQUE : Effectuez les étapes de post-fixation, de lavage et de blocage dans ce format de plaque.
3. Post-fixez les gouttelettes avec 1 mL de solution glacée d’acétone :méthanol 50:50 pendant ~1 min (le bord des gouttelettes deviendra blanc).
   REMARQUE : Effectuez cette étape dans la hotte car l’acétone et le méthanol sont dangereux pour la santé.
4. Rincez avec 3 à 5 lavages dans 2 mL de PBS (les gouttelettes couleront dans la solution PBS lorsque la réhydratation sera terminée).
   REMARQUE : Évitez de toucher les gouttelettes avec la pointe de la pipette car, après post-fixation, elles sont collantes au plastique. Tout au long du protocole, évitez d’aspirer des solutions de post-fixage, d’anticorps, de blocage et de lavage par aspiration, car cela pourrait endommager ou détruire complètement les gouttelettes. Au lieu de cela, inclinez la plaque et retirez soigneusement les solutions à l’aide d’une pipette de 500 à 5 000 μL.
5. Centrifugez la solution de blocage pendant 15 min à 21 000 x g et 4 °C afin d’éliminer les débris.
   REMARQUE : La solution peut être aliquote dans des tubes de 1,5 mL pour la centrifugation. La solution non utilisée peut être stockée à 4 °C et utilisée pour toutes les étapes ultérieures pertinentes.
6. Incuber les gouttelettes dans une solution de blocage de 500 μL pendant 2 h à RT.
   REMARQUE : Pour réduire le volume de solution de blocage utilisé, la plaque peut être inclinée sur un support et aussi peu que 300 μL de solution/gouttelette peuvent être utilisées.
7. Préparez le mélange d’anticorps primaires (au moins 30 μL/gouttelette) à la dilution appropriée dans une solution bloquante et centrifugez pendant 15 min à 21 000 x g et 4 °C.
8. Transférez les gouttelettes dans une plaque ronde à 96 puits à fond en U à l’aide d’une spatule à bord arrondi, et incubez avec au moins 30 μL/gouttelette du mélange d’anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C.
9. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque à 12 puits contenant 2 mL de solution de lavage/puits, rincez avec trois lavages de 5 minutes d’abord, puis avec neuf lavages de 30 minutes. Laisser le dernier lavage (2 mL) toute la nuit à 4 °C.
10. Le lendemain, rincez trois fois avec du PBS et transférez les gouttelettes dans une plaque ronde à fond en U de 96 puits.
11. Pendant les lavages, préparer le mélange d’anticorps secondaires conjugué au fluorophore approprié (dilué 1:500, au moins 30 μL/gouttelette) dans une solution bloquante et centrifuger pendant 15 min à 21 000 x g et 4 °C.
12. Transférez les gouttelettes dans une plaque ronde à fond en (U) à 96 puits à l’aide d’une spatule à bord arrondi et incubez avec au moins 30 μL du mélange d’anticorps secondaires, pendant 4 h à RT, à l’abri de la lumière.
    REMARQUE : Effectuez toutes les incubations et étapes de lavage ultérieures à l’abri de la lumière.
13. Transférez les gouttelettes dans une plaque à 12 puits contenant 2 mL de solution de lavage/puits à l’aide d’une spatule à bord arrondi, rincez avec trois lavages de 5 minutes d’abord, puis avec quatre lavages de 30 minutes. Laisser le dernier lavage (2 mL) toute la nuit à 4 °C.
14. Le lendemain, rincez les gels avec cinq lavages de 30 minutes puis trois fois avec du PBS. Laisser le dernier lavage (2 mL) toute la nuit à 4 °C.
15. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque ronde à fond en (U) à 96 puits à l’aide d’une spatule à bord arrondi et contre-colorez les noyaux en incubant avec 10 μg/mL de colorant nucléaire Hoechst (au moins 30 μL/gouttelette) pendant 30 minutes à RT.
    REMARQUE : Un support de montage complété par du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la contre-coloration des noyaux peut également être utilisé. Dans ce cas, cette étape et l’étape 1.16 sont sautées, passant directement à l’étape 1.17.
16. Transférez les gouttelettes dans une plaque à 12 puits contenant 2 mL de PBS/puits à l’aide d’une spatule à bords arrondis et rincez trois fois avec du PBS.
17. Montez les gouttelettes sur la lame de microscope comme suit :
    1. Appliquez une fine couche de support de montage à durcissement rapide sur les bords d’un verre de protection de forme carrée de 22 mm x 22 mm et laissez sécher pendant ~1 minute. Effectuez cette étape pour chaque goutte individuellement, afin d’éviter un durcissement excessif du support de montage.
       REMARQUE : Effectuez cette étape dans la hotte car le fluide de montage à durcissement rapide est dangereux pour la santé.
    2. Rincez la gouttelette en la trempant dans un puits d’une plaque à 12 puits contenant 2 mL d’eau déminéralisée et transférez-la sur une lame de microscope, à l’aide d’une spatule à bord arrondi. Enlevez l’excès d’eau à l’aide d’un petit morceau de papier absorbant.
    3. Distribuez 15 μL de produit de montage anti-décoloration non durcissant sur la gouttelette.
       REMARQUE : Alternativement, si la coloration nucléaire Hoechst n’a pas été utilisée, un support de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) peut être utilisé.
    4. Positionnez doucement le verre de protection, avec le support de montage à durcissement rapide face à la lame microscopique, sur la gouttelette et laissez se déposer.
       REMARQUE : Le médium à durcissement rapide se collera à la lame microscopique et maintiendra la gouttelette en place.
18. Répétez l’étape 1.17 pour toutes les gouttelettes. Montez deux gouttelettes sur chaque lame de microscope.
19. Laissez les diapositives sécher à l’air libre à RT pendant ~2 h et stockez-les à 4 °C pendant la nuit. Assurez-vous que les lames sont positionnées horizontalement et à l’abri de la lumière.
20. Imagez les cultures ex vivo natives ou finales colorées à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope à épifluorescence droit équipé d’une fonction de sectionnement optique et d’un objectif 20x ou 40x. Utilisez la fonction de tuile pour capturer une plus grande surface du tissu à la fois.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
Plaques de culture cellulaire, 96-puits, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Utilisé pour l’immunofluorescence
Spatules rondes/plates, acier inoxydable	VWR	82027-528	Utilisé pour l’immunofluorescence en monture entière
Couvre-lames 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Utilisé pour le
Lames de microscope	Fisher	Kindler K102	Utilisé pour le
Papier absorbant	VWR	115-0202	Utilisé pour le
Tablettes PBS	Medicago	09-9400-100	Utilisé pour la préparation de 1x PBS
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Utilisé pour préparer la solution post-fixation. NOCIF : porter des gants et/ou des vêtements de protection. Utilisation dans la hotte.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Utilisé pour préparer la solution de post-fixation. TOXIQUE : porter des gants et/ou des vêtements de protection. Utilisation dans la hotte.
Triton X-100 (éthoxylate d’octylphénol)	Sigma-Aldrich	T9284	Utilisé pour l’immunofluorescence à monture entière. NOCIF : porter des gants et/ou des vêtements de protection.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	Pour la contrecoloration des noyaux. NOCIF : porter des gants et/ou des vêtements de protection, ainsi qu’une protection oculaire et/ou faciale.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Portez des gants et/ou des vêtements de protection et des lunettes de protection. Utilisation dans la hotte.
VECTASHIELD Antifade Medium avec DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Medium de montage avec contre-coloration des noyaux. Portez des gants et/ou des vêtements de protection et des lunettes de protection. Utilisation dans la hotte.
Eukitt Medium de montage à durcissement rapide	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC : Portez des gants et/ou des vêtements de protection et des lunettes de protection. Utilisation dans la hotte.
Humain recombinant VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL concentration
Humain recombinant VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL concentration finale
TGFβ humain recombinant	Millipore	GF346	1 ng/ mL concentration
Recombinant humain bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL concentration
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Utilisé à une dilution de 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Utilisé à une dilution de 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Utilisé à une dilution de 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Utilisé à une dilution de 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Signalisation cellulaire	9664	Utilisé à une dilution de 1:200, Chèvre anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Utilisé à une dilution de 1:100, Chèvre anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Utilisé à une dilution de 1:100, Chèvre anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Utilisé à une dilution de 1:1500, Chèvre anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	Systèmes de R&D	AF2089	Utilisé à une dilution de 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Utilisé à une dilution de 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Utilisé à une dilution de 1:200, Chèvre anti Lapin Alexa 568 Secondaire Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Utilisé à une dilution de 1:40, Poulet anti Chèvre Alexa 594 Secondaire Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Utilisé à une dilution de 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Utilisé à une dilution de 1:400, Cy3 conjugué
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Utilisé à 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Utilisé à 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Utilisé à 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Utilisé à 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Sondes moléculaires	A-21468	Utilisé à 1:500 dilution
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscopes
Microscope à épifluorescence inversée Axiovert 200	Zeiss	<
AxioImager.Z1 microscope à épifluorescence droit avec Apotome	Zeiss		Pour l’imagerie du FT immunocoloré à monture entière

en monture entière montage montage montage finale finale finaletd style='largeur :194pt ;'>Pour l’imagerie du FT frais et incrusté de fibrine