Immunomarquage de neurones dans des tranches de cerveau de souris suite à une hybridation in situ par fluorescence

Source : Baleriola, J., et. al., Détection d’ARNm localisés axonalement dans des sections de cerveau à l’aide de l’hybridation in situ à haute résolution. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre la détection de l’ARNm dans les axones cholinergiques dans des tranches d’hippocampe de souris fixes à l’aide de l’hybridation fluorescente in situ et de la coloration par anticorps. La microscopie à fluorescence révèle la localisation spatiale des ARNm marqués par sonde et de la choline acétyltransférase dans les neurones cholinergiques.

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

test FISH suivi d’une immunohistochimie à l’aide du démasquage d’antigènes/ARN induits par la chaleur
1. Avant de commencer, préparez tout le matériel requis :
  1. Chauffez le four d’hybridation à 40 °C et placez un plateau contenant de l’eau distillée dans le four pour créer un environnement humidifié.
  2. Prenez une boîte à diapositives et placez des serviettes en papier trempées dans de l’eau distillée à l’intérieur pour l’humidifier. Ensuite, placez la boîte à glissières dans le four d’hybridation.
  3. Sortez les sondes (sondes négatives et cibles) du réfrigérateur et chauffez-les dans le four d’hybridation pendant 10 minutes. Ensuite, laissez les sondes refroidir à RT.
  4. Équilibrez les réactifs d’amplification AMP 1-4 (inclus dans le kit de réactifs multiplex fluorescents) chez RT.
  5. Préparez la solution de récupération de l’antigène : 10 mM de citrate de sodium (pH 6), 0,05 % Tween 20. Remarque : La solution peut être conservée indéfiniment à la RT et être utilisée pour une coloration future.
  6. Préparez 1x tampon de lavage en diluant la solution mère 50x (dans le kit de réactifs multiplex fluorescents) dans de l’eau sans RNase ou traitée au DEPC.
    REMARQUE : 1x tampon de lavage peut être stocké chez RT pendant 1 mois et être utilisé pour de futures taches. Un tampon de lavage 50x peut précipiter. Si c’est le cas, chauffez le tampon de lavage 50x à 40 °C pendant 10 min avant de préparer la solution 1x.
2. Retirez les diapositives de l’éthanol à 100 % et faites-les sécher à l’air libre pendant 5 min à RT.
3. Préparez un pot de coplin contenant 50 ml de solution de récupération d’antigène. Plongez les lames dans une solution de récupération d’antigène et faites-les bouillir pendant 10 minutes dans un four à micro-ondes.
  REMARQUE : Vous pouvez également placer les lames horizontalement dans un plat en verre rond de 100 mm de diamètre contenant 100 ml de solution de récupération.
  1. Remplissez un bécher de 1 L d’eau distillée et placez-le au micro-ondes.
    REMARQUE : L’eau va « tamponner » la chaleur lors du démasquage.
  2. Placez les lames dans une solution de récupération d’antigène à l’intérieur du micro-ondes. Faire bouillir les diapositives à haute puissance pendant 5 min. Immédiatement après que les échantillons ont cessé d’bouillir, la chaleur glisse à nouveau à haute puissance pendant 5 minutes supplémentaires.
  3. Refroidir les diapositives à RT.
    REMARQUE : ÉTAPE CRITIQUE : la durée et la procédure d’ébullition doivent être déterminées par l’utilisateur, en fonction des caractéristiques du micro-ondes. Plus l’ébullition commence rapidement, plus les risques d’évaporation de la solution sont élevés. Dans ce cas, il est recommandé de faire bouillir les échantillons pendant des périodes plus courtes, plus de deux fois pour effectuer un temps total de démasquage de 10 minutes. Au contraire, si le chauffage est effectué à puissance moyenne ou faible, le démasquage peut être effectué une fois pendant 10 min. Cependant, si les échantillons ne bouillent pas en continu pendant environ 10 minutes au total, cela peut entraîner un démasquage partiel de l’ARN cible et de la protéine à détecter.
4. Lavez les diapositives trois fois avec 1x PBS.
5. Ajoutez 2 à 3 gouttes (~100 μl) de la sonde dapB réglée sur les tranches de cerveau utilisées pour évaluer la coloration de fond. REMARQUE : La sonde dapB réglée cible un gène bactérien et ne doit reconnaître aucun ARN de mammifère.
6. Ajoutez 2 à 3 gouttes de la sonde de ciblage réglée sur les tranches de cerveau utilisées pour détecter l’ARN d’intérêt. REMARQUE : une sonde ciblant les résidus 20 à 1 381 de l’ARNm Atf4 de la souris est utilisée dans cet exemple.
7. Couvrez les lames avec du parafilm pour éviter l’évaporation de la sonde, placez-les dans la boîte à lames humidifiée à l’intérieur du four d’hybridation, et incubez-les à 40 °C pendant 2 heures.
  REMARQUE : FACULTATIF : des tranches de cerveau supplémentaires peuvent être hybridées avec un ensemble de sondes ciblant la souris Polr2A et utilisées comme contrôles positifs.
8. Lavez les diapositives deux fois avec 1x tampon de lavage pendant 2 min à RT.
9. Ajoutez 2 à 3 gouttes de réactif d’amplification AMP 1-FL à chaque tranche de cerveau, recouvrez les lames de parafilm, placez-les dans la boîte à diapositives et incubez à 40 °C pendant 30 min dans le four d’hybridation.
10. Lavez les diapositives deux fois avec 1x tampon de lavage pendant 2 min à RT.
11. Ajoutez 2 à 3 gouttes de réactif d’amplification AMP 2-FL à chaque tranche de cerveau, recouvrez les lames de parafilm, placez-les dans la boîte à lames et incubez à 40 °C pendant 15 min dans le four d’hybridation.
12. Lavez les diapositives deux fois avec 1x tampon de lavage pendant 2 min à RT.
13. Ajoutez 2 à 3 gouttes de réactif d’amplification AMP 3-FL à chaque tranche de cerveau, recouvrez les lames de parafilm, placez-les dans la boîte à diapositives et incubez à 40 °C pendant 30 min dans le four d’hybridation.
14. Lavez les diapositives deux fois avec 1x tampon de lavage pendant 2 min à RT.
15. Ajoutez 2 à 3 gouttes de réactif d’amplification AMP 4-FL à chaque tranche de cerveau, recouvrez les lames de parafilm, placez-les dans la boîte à diapositives et incubez à 40 °C pendant 15 min dans le four d’hybridation.
16. Lavez les lames deux fois avec 1x tampon de lavage pendant 2 min à RT et deux fois avec 1x PBS.
17. Ajoutez 100 à 200 μl (ou un volume suffisant pour couvrir complètement les tranches) d’une solution bloquante contenant 3 mg/ml de BSA, 100 mM de glycine et 0,25 % de Triton X-100 dans du PBS (pH 7,4) sur les lames, couvrez-les de parafilm et incubez pendant 30 min à RT.
18. Ajoutez 100 à 200 μl d’anticorps anti-ChAT dilué dans une solution bloquante (1/100) sur les lames, couvrez-les de parafilm et incubez pendant 2 jours à 4 °C. Assurez-vous que les tranches de cerveau ne se dessèchent pas. Au besoin, réappliquez la solution d’anticorps anti-ChAT sur les tranches de cerveau 24 heures après l’incubation.
19. Lavez les diapositives trois fois en 1x PBS pendant 5 min à RT.
20. Ajoutez 100 à 200 μl de l’anticorps secondaire approprié conjugué à Alexa (par exemple, Alexa-594 âne anti-chèvre pour cet exemple particulier) aux lames, recouvrez de parafilm et incubez pendant 1 heure à RT.
21. Lavez les diapositives trois fois en 1x PBS pendant 5 min à RT.
22. Lavez les lames une fois avec de l’eau distillée.
23. Montez les diapositives avec un support de montage contenant DAPI.
24. Visualisez des tranches de cerveau sous un microscope à fluorescence.

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sonde personnalisée ciblant les résidus 20-1381 de l’ARNm Atf4 de la souris (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Sonde personnalisée ciblant les résidus 15-1256 de l’ARNm ATF4 humain (NM_001675.2)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Negative control sonde-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Probe
Sonde-souris de contrôle positif Polr2A (facultatif)	Advanced Cell Diagnostics	312471	Probe
Anticorps polyclonal anti-ChAT<	AB144P
Support de montage ProLong Gold avec DAPI	Life Technologies	P36935
Kit de réactifs multiplex fluorescents RNAscope (pour la détection de fluorescence)	Advanced Cell Diagnostics	320850	Kit d’hybridation in situ

Immunomarquage de neurones dans des tranches de cerveau de souris suite à une hybridation in situ par fluorescence

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