Imagerie à haute résolution des récepteurs de neurotransmetteurs au niveau des synapses rétiniennes

Résumé

Source : Zhang, J., et al. Analyse quantitative immunogold à haute résolution des récepteurs membranaires au niveau des synapses du ruban rétinien. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une technique de microscopie électronique pour visualiser la localisation des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses rétiniennes. Les coupes rétiniennes contiennent des cellules ganglionnaires rétiniennes qui présentent des récepteurs de neurotransmetteurs liés à la membrane et sont marquées avec la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB). Lors du marquage des marqueurs avec des anticorps conjugués à des nanoparticules d’or et de la contre-coloration de la section avec des métaux lourds, les récepteurs RGC sont visualisés au microscope.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Fixation des tissus rétiniens

1. Assemblez les matériaux et outils suivants : Un microscope à dissection, 2 pinces à pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre en cellulose, une pipette en plastique et une lame de microscope.
2. Anesthésie le rat dans une chambre fermée avec 2,0 ml d’halothane (un anesthésique inhalé). Déterminez l’anesthésie adéquate par ces méthodes : absence de retrait de la patte arrière après le pincement de l’orteil ou absence de réflexe de clignement des yeux. Puis décapitez immédiatement avec une guillotine. Retirez les yeux à l’aide d’une paire de ciseaux à iris et placez-les dans un plat en verre contenant 4 % de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate (PB) 0,1 M à pH 7,4.
3. À l’aide du microscope de dissection, retirez la cornée en coupant l’avant du globe oculaire. Retirez le cristallin et le vitré de la surface interne de la rétine à l’aide d’une pince.
4. Pelez la sclérotique avec les deux pinces jusqu’à ce que la rétine soit isolée de l’œilleton.
5. Coupez immédiatement la rétine en bandes de 100 à 200 μm d’épaisseur avec un rasoir, et soumises à une fixation par décalage du pH.
6. Fixez les bandelettes rétiniennes dans 4 % de paraformaldéhyde dans 0,1 M PB à pH 6,0 pendant 20 à 30 min, puis dans du paraformaldéhyde à 4 % plus 0,01 % de glutaraldéhyde à pH 10,5 pendant 10 à 20 min à température ambiante (RT).
7. Après plusieurs lavages en PB avec 0,15 mM de CaCl₂ (pH 7,4 à 4°C), cryoprotégez les bandelettes rétiniennes avec du glycérol (60 min chacune dans 10 %, 20 %, 30 %, puis une nuit [O/N] dans 30 %) dans 0,1 M PB avant la substitution de congélation.

2. Substitution de gel

REMARQUE : Cette méthode de substitution de gel est modifiée à partir d’un protocole publié précédemment. De plus, il est crucial que les instruments soient très froids (portez des gants) ; Sinon, le tissu peut dégeler partiellement au contact des instruments. Toutes ces étapes sont effectuées à l’intérieur de la chambre de congélation-substitution automatique (AFS) et les instruments ne sont jamais autorisés à se déplacer au-dessus du bord de la chambre. De même, il est nécessaire de refroidir correctement tous les produits chimiques utilisés dans l’AFS.

1. Plongez et congelez les bandelettes rétiniennes dans du propane liquide à -184°C dans un instrument de cryoconservation au microscope électronique (EM). À l’aide d’un pinceau fin, placez les échantillons sur de petits morceaux de ruban adhésif double fixés aux bouts de métal qui vont à l’extrémité des tiges plongeantes (évacuez le tampon supplémentaire à l’aide du pinceau).
2. Plongez les tiges dans le propane liquide et maintenez-les à cet endroit pendant environ 5 secondes, puis transférez-les dans l’instrument de congélation par substitution automatique (AFS) à l’aide d’une petite chambre de transport remplie d’azote liquide (conteneur de cryotransfert refroidi LN₂).
3. Après avoir placé l’échantillon congelé et les instruments (pinces et scalpel) dans l’AFS, refroidissez les instruments dans la chambre pendant plusieurs minutes avant de toucher le tissu, ou refroidissez-les en plaçant les pointes des instruments pendant quelques secondes dans la petite chambre de transport (remplie d’azote liquide (conteneur de cryo-transfert refroidi LN₂)).
4. Une fois dans l’AFS, Retirez l’échantillon et le ruban adhésif du talon à l’aide d’un scalpel fin. De plus, gardez le contrôle du débit d’azote gazeux, TF (TF est décrit comme un « contrôle de régulateur pour le vaporisateur LN₂ ») ouvert pendant ces procédures.
5. Avant de placer le tissu congelé dans les supports à encastrement plat (i.e., avant de configurer l’AFS), découpez un cercle mince dans une feuille de plastique transparente et placez-le au fond du support pour tapisser le fond de chaque puits. Cela permet un retrait relativement plus facile des blocs d’échantillons polymérisés une fois terminé.
   REMARQUE : Auparavant, nous utilisions une méthode alternative aux supports d’enrobage plats, et en utilisant des capsules doubles Reichert+gélatine.
6. Utilisez la séquence automatique suivante dans l’AFS (en utilisant la terminologie de l’instrument) : T1 = -90 °C pendant 32 heures, S1 = augmentation de la température de 4 °C/h (11,3 heures), T2 = -45 °C pendant 50 heures, S2 = augmentation de la température de 5 °C/h (9 heures), T3 = 0 °C pendant 40 heures (total = 142,3 heures). Il peut s’écouler de 2 à 4 heures avant de placer les échantillons dans l’AFS (à -90 °C) avant de commencer la séquence chronométrée.
7. Immergez les sections congelées dans de l’acétate d’uranyle à 1,5 % dans du méthanol à -90 °C pendant >32 heures dans l’AFS. Placez deux morceaux de mouchoirs (généralement) dans chacun des sept puits du support en aluminium à encastrement plat (trois s’insèrent dans l’AFS).
   1. Placez le tissu + ruban dans l’acétate d’uranyle/méthanol dans les puits et retirez le ruban plus tard, juste avant de commencer l’infiltration du milieu d’enrobage (tel que Lowicryl HM20), s’il est trop difficile de retirer le tissu du ruban.
8. Augmentez ensuite la température progressivement jusqu’à -45°C (+4°C par heure ; dans la séquence automatique).
9. Lavez les échantillons trois fois dans du méthanol prérefroidi, en utilisant une pipette en plastique à pointe fine pour retirer l’ancienne solution de chaque support à enrobage plat, puis à l’aide d’une autre pipette en plastique standard pour ajouter le méthanol frais prérefroidi.
10. Ensuite, en utilisant la même méthode, infiltrez progressivement les échantillons avec des résines d’enrobage à basse température telles que le milieu d’enrobage (HM20/méthanol à 1:1 et 2:1, chacun pendant 2 heures, suivi de résine pure pendant 2 heures, puis changez les résines et conservez O/N).
11. Changez à nouveau la résine le lendemain, en ajustant le niveau de la résine pour atteindre juste le bord supérieur des puits.
12. Polymérisez les échantillons (-45°C à 0°C en séquence automatique ; +5°C par heure) avec de la lumière ultraviolette (UV) pendant 40 heures.
13. Puis retirez les échantillons de l’AFS. En règle générale, les blocs d’échantillons présentent encore une certaine couleur rose. Placez les échantillons près de la lumière fluorescente dans la hotte chimique, à RT O/N ou plus longtemps jusqu’à ce qu’ils apparaissent complètement clairs.

3. Post-intégration EM Immunogold Immunocytochimie

1. Coupez des sections de 1 μm avec de l’ultramicrotome, colorez des sections avec 1 % de bleu de toluidine et examinez-les pour l’orientation de la section ; Orientez le bloc de tissu pour obtenir le plan transversal optimal de section.
2. Découpez des sections ultraminces de 70 nm d’épaisseur avec un ultramicrotome et collectez-les sur des grilles à fentes en nickel recouvertes de carbone Formvar.
3. Laver les grilles une fois dans un lavage distillé H₂O, suivi d’une solution saline tamponnée au Tris trois fois (TBS, 0,05 M tampon Tris, 0,7 % NaCl, pH 7,6).
4. Incuber des grilles dans des gouttes de 20 μl d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans du TBS pendant 30 min, puis dans 20 gouttes d’un mélange contenant la sous-unité B de la toxine anti-choléra de chèvre (anti-CTB, 1:3 000) et un anticorps dirigé contre une sous-unité du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDAR glutamatergique de lapin, sous-unité A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30), ou un récepteur anti-lapin GluA2/3 (récepteur hétérotétramétique de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique [AMPA], 1:30) dans TBS-Triton (TBST, 0,01 % Triton X-100, pH 7,6) avec 2 % BSA et 0,02 M NaN₃ O/N à RT.
5. Laver les grilles sur trois gouttes distinctes (20 μl) de TBS (pH 7,6) pendant 10, 10 et 20 min, puis par TBS (pH 8,2) pendant 5 min.
6. Incuber les grilles pendant 2 h gouttes (20 μl) d’un mélange contenant de l’immunoglobuline G anti-lapin (IgG, 1:20) couplée à des particules d’or 10 nm et des IgG anti-chèvre d’âne (1:20) couplées à des particules d’or 18 nm dans du TBST (pH 8,2) avec 2 % de BSA et 0,02 M NaN₃.
7. Lavez les grilles dans des gouttes de 20 μl de TBS (pH 7,6) pendant 5, 5 et 10 min, puis dans de l’eau ultra-pure puis séchez-les.
8. Grilles de contre-coloration avec 5 % d’acétate d’uranyle et 0,3 % de citrate de plomb dans du H₂O distillé pendant 8 et 5 min dans des conditions sombres, respectivement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycérol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Âne anti-lapin IgG-10 nm particules d’or	EMS	25704	Dilution 1/20
Âne anti-souris IgG-10 nm particules d’or	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-souris IgG-5 nm particules d’or	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-chèvre IgG-18 nm particules d’or	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Grilles à fentes en nickel revêtues de Formvar-Carbon.	EMS	FCF2010-Ni
Acétate d’uranyle	EMS	22400-1
Méthanol	EMS	67-56-1
Citrate de plomb	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
azote liquide	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
Liste CTB	Laboratoires biologiques	104	1-1.2 %
Liste anti-CTB	Laboratoires biologiques	703	Dilution 1/4000