Cette vidéo montre la méthode de surveillance de l’activation en temps réel des récepteurs odorants dans les cellules de mammifères recombinants à l’aide de la mesure de la luminescence. La liaison odorante déclenche l’activation de la protéine G et la production d’AMPc, activant les protéines glocapteurs qui émettent de la luminescence lors de la liaison au substrat, fournissant une mesure quantitative de la réponse du récepteur.
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Article de méthode
Surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants dans les cellules recombinantes
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28 avril 2025
Dans cet article
Résumé
Protocole
1. Hana3A Cells Culture
- Préparez M10 (Minimum Essential Medium (MEM) plus 10 % v/v de sérum fœtal bovin (FBS)) et M10PSF (M10 plus 100 μg/mL de pénicilline-streptomycine et 1,25 μg/mL d’amphotéricine B).
- Cultivez les cellules dans 10 mL de M10PSF dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Divisez les cellules tous les 2 jours avec un rapport de 20 % : lorsque la confluence de 100 % des cellules (environ 1,1 x 107 cellules) est observée sous un microscope à contraste de phase, aspirez le milieu et lavez doucement les cellules avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Aspirez le PBS et ajoutez 3 mL d’acide trypsine-éthylène diamine tétraacétique à 0,05 % (EDTA, 0,48 mM). Laisser agir environ 1 minute, jusqu’à ce que les cellules se dissocient de la plaque.
- Ajoutez 5 mL de M10 pour inactiver la trypsine et éventuellement détacher les cellules encore attachées à la plaque en pipetant de haut en bas.
- Transférez le volume (8 mL) dans un tube de 15 mL et centrifugez à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 mL de M10PSF en pipetant de haut en bas pour briser toute masse cellulaire. Évitez de créer des bulles dans le tube.
- Transférez 1 mL de la solution de cellules remises en suspension dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 100 mm et ajoutez 9 mL de M10PSF frais. Incuber à 37 °C et 5 % CO2.
2. Préparation des cellules pour la transfection
- Évaluez la confluence, ou le nombre de cellules, en les observant sous un microscope à contraste de phase. Une confluence d’au moins 10 % (environ 1,1 x 106 cellules) est nécessaire pour une plaque.
- Aspirez le support et lavez doucement les cellules avec 10 mL de PBS. Aspirez le PBS et ajoutez 3 ml d’EDTA. Laisser agir environ 1 min à température ambiante, jusqu’à ce que les cellules se dissocient de la plaque.
- Ajoutez 5 mL de M10 pour inactiver la trypsine et éventuellement détacher les cellules encore attachées à la plaque en pipetant de haut en bas. Transvaser le volume (8 ml) dans un tube de 15 ml et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 mL de M10PSF en pipetant de haut en bas pour briser toute masse cellulaire. Évitez de créer des bulles dans le tube.
- Selon le nombre de plaques à transfecter, transférez une quantité appropriée de cellules dans un réservoir avec le volume correspondant approprié de M10PSF. Une plaque à 96 puits doit être plaquée avec 1/10 d’une boîte de 100 mm confluente à 100 % (environ 1,1 x 106 cellules) diluée dans du M10PSF pour atteindre un volume total de 6 mL. Pour une plaque à 96 puits commençant par une boîte de 100 mm de confluence à 100 %, ajoutez 500 μL des 5 mL de cellules remises en suspension à 5,5 mL de M10PSF frais. Mélangez les cellules et le M10PSF sans générer de bulles d’air.
- Pipette 50 μL des cellules suspendues dans chaque puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber toute la nuit à 37 °C et 5 % CO2.
3. Transfection
- plasmidiqueObservez la plaque à 96 puits sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 30 % et 50 %.
- Préparez un premier mélange de transfection qui contient les plasmides communs à l’ensemble de la plaque (une version plus courte de la protéine de transport du récepteur 1 (RTP1S), du récepteur odorant (OR) et de la protéine Glosensor ; voir le tableau des matériaux) après les volumes du tableau 1. Notez que la quantité de RO marqués Rho doit être divisée par le nombre de RO s’il y en a plusieurs.
REMARQUE : Nous conseillons vivement d’ajouter un contrôle négatif vectoriel vide (ici Rho-pCI) et tout contrôle positif (OU connu pour répondre à l’odorant testé) au plan d’expérience. - Préparez un deuxième mélange de transfection contenant 500 μL de MEM et 20 μL de réactif Lipofectamine 2000 (valable pour une plaque de 96 puits, voir le tableau des matériaux). Ajoutez le deuxième mélange au premier, et mélangez doucement en pipetant de haut en bas et incubez pendant 15 min à température ambiante. Ajouter 5 mL de M10 et mélanger délicatement.
- Remplacez le M10PSF dans la plaque à 96 puits précédemment plaquée par 50 μL du support de transfection final. Incuber dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de CO2 et aspirer la chambre du luminomètre pendant la nuit.
4. Substrate Incubation
- Observez la plaque à 96 puits sous un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence cellulaire entre 60 % et 100 %. Préparez une solution de simulation de la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant 10 mM d’acide hydroxyéthyl pipérazinéthanesulfonique (HEPES) et 5 mM de D-glucose.
- Diluez 75 μL de la solution de réactif d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) (voir le tableau des matériaux) à 2,75 mL de la solution de stimulation. Retirez le milieu de transfection de la plaque à 96 puits et lavez les cellules en ajoutant 50 μL de solution de stimulation fraîche dans chaque puits.
- Retirez la solution de stimulation et ajoutez 25 μL de solution de réactif d’AMPc préparée à l’étape 4.2 dans chaque puits. Incuber la plaque à 96 puits à température ambiante dans un environnement sombre et sans odeur (par exemple, un tiroir propre et vide, loin des produits chimiques ou de toute source odorante) pendant 2 h.
5. stimulation odorante
- Tout d’abord, équilibrez la chambre du luminomètre avec les molécules odorantes volatiles. Diluer l’odorant à la concentration désirée dans 10 mL d’huile minérale (figure 1A). Avant la fin du temps d’incubation du réactif AMPc, ajoutez 25 μL de la solution odorante dans une nouvelle plaque à 96 puits (pas celle contenant les cellules). Incuber cette plaque odorante à température ambiante dans la chambre du luminomètre pendant 5 min (Figure 1B) (aucun enregistrement du luminomètre n’est requis ici).
- Règle le luminomètre pour enregistrer la luminescence avec 0 s de retard pendant 20 cycles de mesure de plaque de 90 s avec 0,7 s d’intervalle entre les cycles.
- Juste avant de lire la plaque, retirez la plaque odorante de la chambre. Ajoutez 25 μL d’odorisant entre les puits de la plaque de 96 puits contenant les cellules (n’ajoutez pas l’odorisant dans les puits contenant les cellules) et démarrez rapidement la mesure de la luminescence de tous les puits pendant 20 cycles en 30 minutes (figure 1C).
Tableau 1 : Mixage pour la transfection. Quantités de plasmides (protéine Glosensor, RTP1S et OR) à ajouter au MEM pour le transfecter sur une plaque de 96 puits.
Par plaque à 96 puits
MEM | 500 μL |
pGlosensor | 10 ng |
RTP1S | 5 ng |
OR | 75 ng |
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Résultats
Figure 1 : Protocoles schématiques pour la surveillance en temps réel de l’activation des récepteurs odorants par l’odorisant vaporisé. L’odorisant (violet) a été dilué à la conce...
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05 % Trypsine - EDTA (1x), rouge phénol - conserver à 4 °C |
| 100 mm de culture cellulaire | BD Falcon | 353003 | |
| tube de 15 ml | BD Falcon | ||
| 352099 | tubes coniques de 17 mm x 120 mm | ||
| plaque à 96 puits | Corning | ||
| 3843 | 96 puits, avec couvercle LE blanc avec fond transparent Polystyrène enduit de poly-D-lysine | ||
| Amphotéricine | Gibco | ||
| 15290-018 | amphotéricine B 250 μg/mL - stocker à 4 °C | ||
| Centrifugeuse< | C312 | Machine centrifugeuse avec rotor à godet oscillant pour 15 mL | |
| Hotte de classe II Type A/B3 | NUAIRE | NU-407-500 | Capot pour la culture |
| FBS | 16000-044 | Sérum de veau fœtal - conserver à -20 °C | |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Substrat de protéine luminescente - stocker à -20 °C |
| Incubateur 37 °C ; 5 % dioxyde de carbone | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubateur pour la culture cellulaire |
| réactif de lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Réactif de transfection 1mg/ml - stocker à 4° C |
| Luminomètre POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued style='couleur-de-fond :#ffffff ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :haut ;'>96 lecteur de plaque de puits pour luminescence | |
| Huile minérale | Sigma | M8410 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle avec sels d’Earle et L-glutamine - conserver à 4 °C |
| Pénicilline/Streptomycine | Sigma Aldrich | P4333< | |
| pGlosensor | Promega | E2301 | plasmide de protéine luminescente pGloSensor-22F cAMP - stocker à 4 °C |
| Microscope à contraste de phase | Leica | 090-131.001 | Microscope à contraste de phase avec objectifs x4, x10, x20 |
| RTP1S | H. Matsunami lab | - | 100 ng/μL plasmide - |
