Induction de la formation de caillots sanguins dans le cerveau de la souris à l’aide d’un colorant photosensible

Résumé

Source : Talley Watts, L., et al. Photothrombose du Bengale de Rose par imagerie optique confocale in vivo : un modèle d’accident vasculaire cérébral d’un seul vaisseau. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo présente une technique permettant d’induire la formation de caillots sanguins dans le cerveau d’une souris. Une souris anesthésiée avec une fenêtre crânienne et un crâne aminci subit une photothrombose par l’activation d’un colorant photosensible à l’aide d’une lumière de haute intensité. Ce processus génère des espèces réactives de l’oxygène, qui endommagent les parois des vaisseaux et déclenchent la formation de caillots, obstruant finalement le flux sanguin vers le cerveau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Anesthésie pour la préparation corticale

1. Placez la souris dans une chambre d’induction avec 2-3 % d’isofluorane mélangé à de l’oxygène pour induire l’anesthésie. Observez la diminution du rythme respiratoire au fur et à mesure que la souris est induite. Pincez la patte de la souris pour déterminer si la souris est prête à se déplacer vers le cône nasal. Remarque : Le niveau d’anesthésie est une étape critique dans toute préparation in vivo et il faut veiller à ne pas induire un niveau qui provoquera une ischémie globale.
2. Une fois que la souris est suffisamment anesthésiée, transférez l’animal sur la plate-forme de chirurgie/imagerie et placez le nez de la souris dans le cône nasal et appliquez 1 à 1,2 % d’isofluorane pour maintenir un état anesthésié. Assurez-vous que la souris est allongée sur un coussin chauffant à température contrôlée pour maintenir la température corporelle (37 °C +/- 0,5 °C) tout au long des procédures restantes. Placez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Surveillez la physiologie de la souris à l’aide d’un système d’oxymétrie de pouls à l’aide de la pince de queue ou de pied fournie avec le système. Vérifiez que la fréquence respiratoire est maintenue entre 50-65 respirations/min. Vérifiez que la fréquence cardiaque reste entre 300 et 450 bpm et que la saturation en oxygène est maintenue entre 97-98 % pour assurer la survie à long terme de l’animal.
4. Lorsque la souris est correctement anesthésiée, rasez les poils du crâne à l’aide d’une tondeuse électrique, enlevez les poils résiduels et nettoyez avec de la bétadine, puis un tampon d’éthanol. Répétez cette procédure jusqu’à trois fois pour assurer un environnement chirurgical stérile.

2. Intervention chirurgicale

1. Avec le cuir chevelu entièrement nettoyé et rasé, faites une incision de 5 mm dans le cuir chevelu de la souris pour révéler les fissures crâniennes et localiser la brèche.
2. Utilisez un applicateur en coton stérile pour retirer tout fascia restant recouvrant le crâne.
3. Collez un anneau en acier inoxydable sur mesure (Figure 1) avec de l’adhésif tissulaire sur l’os recouvrant le cortex pariétal en utilisant les coordonnées stéréotaxiques de Bregma : -1 à -3 mm et latérale : 2-4 mm. Remarque : La colle durcit généralement dans les 2 minutes suivant la mise en place de l’anneau sur l’os.
4. Fixez l’anneau sur un support stéréotaxique (Figure 2) pour stabiliser la souris et empêcher tout mouvement pendant l’imagerie.
5. Sous un microscope de dissection de qualité chirurgicale, percez lentement une section de 1 à 2 mm dans le crâne à l’aide d’un outil de type dremel à vitesse contrôlée (foret Meisinger de 3,9 mm) en veillant à maintenir la zone à niveau pendant qu’elle est percée. Pour ce faire, utilisez un motif en zigzag. Pour éviter l’accumulation de chaleur, réglez la vitesse de forage sur faible et faites des pauses fréquentes.
6. Lorsque le crâne devient brillant en apparence, continuez l’amincissement du crâne à l’aide d’une lame de scalpel en utilisant le même motif en zigzag pour maintenir la surface amincie à un niveau afin de faciliter l’élimination en douceur des fines couches du crâne crânien. À l’aide de la pointe de la lame du scalpel, effectuez de petits traits linéaires avec une légère pression pour enlever de fines couches d’os à la fois. Continuez jusqu’à ce que le système vasculaire soit clairement visible au microscope de dissection.
7. Si l’expérimentateur perfore ou brise le crâne pendant le processus d’amincissement, euthanasiez l’animal en raison de dommages probables au cortex sous-jacent.
   Remarque : Le crâne de souris a une épaisseur d’environ 300 m et est composé de deux fines couches d’os compact (une couche externe et une couche interne) et d’une couche d’os spongieux prise en sandwich entre les deux couches d’os compact. La couche externe d’os compact et la majeure partie de l’os spongieux sont retirées à l’intérieur de la zone de forage de 5 mm, ce qui laisse une couche d’environ 50 μm d’os compact (voir Figure 2B). La visualisation du système vasculaire permettra de s’assurer que le crâne aminci intact final a une épaisseur d’environ 50 m. Le crâne est donc toujours présent lorsqu’il est aminci à cette épaisseur.

3. Configuration du microscope

1. Utilisez un système de microscope inversé (systèmes conventionnels, confocaux ou à deux photons) doté d’un inverseur d’objectif. Remarque : Il est également possible d’utiliser un microscope vertical standard. Le facteur limitant sera l’espace entre la scène et les objectifs. Des modifications de la scène peuvent être nécessaires pour réaliser cette configuration.
2. Fixez la plate-forme chirurgicale/d’imagerie à une platine sur mesure située à côté de la base du microscope. Remarque : La plate-forme est fabriquée à l’aide d’un vérin de laboratoire pour permettre le mouvement vertical de la plate-forme chirurgicale/d’imagerie sous l’objectif. Le vérin de laboratoire est monté sur une plaque fixée à quatre pôles cylindriques. (Voir Figure 2).
3. Positionnez l’inverseur d’objectif contenant un objectif 20X sur la fenêtre crânienne. Utilisez une source de lumière externe pour trouver la fenêtre crânienne en regardant à travers les oculaires du microscope et positionnez l’objectif dans la zone d’imagerie. Remarque : La zone d’imagerie sera indiquée par la présence du système vasculaire.
4. Pour les objectifs à base d’eau, utilisez du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) (130 mM NaCl ; 30 mM KCl ; 12 mM KH₂PO₄ ; 200 mM NaHCO₃ ; 30 mM d’acide hydroxyéthylpipérazine éthane sulfonique [HEPES] ; et 100 mM de glucose) comme milieu en raison d’une fuite potentielle dans la cavité crânienne pendant l’imagerie (Figure 3).

4. Préparation, administration et induction d’un AVC au Rose Bengale

1. Préparer une solution fraîche à 20 mg/ml de Rose Bengal dans un LCR ; Filtrer et stériliser avant l’administration. Ne réutilisez pas et ne conservez pas le Rose Bengal une fois qu’il a été mélangé. Préparez une nouvelle solution pour chaque expérience.
2. Administrez une injection de 0,1 ml de Rose Bengal dans la veine caudale tout en balayant la fenêtre crânienne avec un laser de 561 nm pour assurer une injection adéquate de la solution. Remarque : Rose Bengal sera visualisé dans les 5 secondes suivant l’injection dans le système vasculaire du cerveau. L’ensemble du récipient doit être rempli de Rose Bengal.
3. Après une injection adéquate du colorant Rose Bengal, choisir un récipient approprié pour la thrombose en fonction du diamètre du vaisseau (40-80 μm) pour assurer la reproductibilité d’un volume de lésion particulier. Faites la différence entre les artères et les veines en regardant la direction du flux sanguin : les artères se déplaceront de vaisseaux de plus grand diamètre à plus petit diamètre, les veines se déplaceront de vaisseaux de plus petit en plus grand diamètre. Ceci est facilement accompli par visualisation une fois que Rose Bengal est injecté.
4. Modifiez le paramètre du microscope comme suit :
   1. Augmentez le temps de séjour. Remarque : Cela variera en fonction du système de microscope utilisé.
   2. Augmentez la puissance du laser à 100 %.
   3. Collectez des images chronologiques à 1 image/s en utilisant la vitesse de balayage maximale.
5. Scannez la souris jusqu’à ce qu’un caillot stable se forme dans le vaisseau. Remarque : Cela se produit généralement dans les 5 minutes suivant l’analyse continue (voir Figure 4).
6. Après l’induction de la formation de caillots à l’aide de Rose Bengal, retirez la souris de la zone d’imagerie et remettez-la dans le microscope de dissection. Retirez avec précaution l’anneau en acier inoxydable du crâne crânien. Examinez la fenêtre crânienne à la recherche d’un saignement. En cas de saignement, mettez fin à l’expérience.
7. Utilisez une suture monofilament 6.0 pour fermer l’incision sur le crâne. Placez une pommade antibiotique le long de la ligne de suture pour prévenir l’infection. Injecter Buprenex (0,05 mg/kg) par voie sous-cutanée toutes les 12 heures pendant trois jours pour la gestion de la douleur.
8. Remettez la souris dans une chambre de récupération après l’avoir retirée de l’anesthésique jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée et se déplace librement.
9. Remettez la souris dans une cage propre pour une enquête plus approfondie ultérieurement.

Résultats

Figure 1 : Anneau en acier inoxydable. Trois vues (vue du dessus, de côté et du bas) sont montrées du support d’anneau en acier inoxydable qui est appliqué sur le crâne de la souris pour le fixer au support stéréotaxique.

Matériaux