Modélisation de la régénération sensorielle des axones chez un rat à l’aide d’une injection de ganglion de la racine dorsale et d’une lésion par écrasement de la racine dorsale

Résumé

Source : Cheah, M., et al. Injection du ganglion de la racine dorsale et blessure par écrasement de la racine dorsale comme modèle de régénération sensorielle des axones. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre une procédure étape par étape pour injecter une suspension virale dans les ganglions de la racine dorsale (DRG) et induire une lésion axonale contrôlée via un écrasement de la racine dorsale chez un rat anesthésié. Le protocole consiste à exposer les DRG, à délivrer un vecteur viral favorisant la croissance pour faciliter la régénération axonale et à sectionner les connexions axonales à la moelle épinière pour modéliser les lésions nerveuses sensorielles et la régénération.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection de DRG et réalisation d’une blessure par écrasement de la racine dorsale

REMARQUE : Il s’agit d’une chirurgie extrêmement délicate. Il est conseillé de s’entraîner sur quelques animaux morts d’abord pour se familiariser avec l’anatomie avant de passer à la chirurgie des animaux vivants.

1. Localisez les apophyses épineuses C2 et T2 proéminentes sur la peau. Faites une incision cutanée entre les apophyses épineuses C2 et T2 avec une lame de scalpel n° 10 (une fois la peau ouverte, une ligne médiane de tissu fibreux blanc doit être visible sur la première couche de muscle ; la première couche de muscle a une texture « gélatineuse »).
2. Faites une incision de taille similaire sur la première couche de muscle le long de la ligne médiane blanche à l’aide d’une lame de scalpel. N’allez pas au-delà de l’apophyse épineuse T2 proéminente, car il y a une branche artérielle majeure de l’aorte descendante située à proximité.
   REMARQUE : Des saignements abondants peuvent survenir n’importe où à partir de cette étape. Arrêtez toujours le saignement et éliminez le sang à l’aide de cotons-tiges stérilisés ou d’éponges chirurgicales résorbables pour permettre une visualisation claire à tout moment. Procéder à la procédure « à l’aveugle » peut entraîner des dommages indésirables à la moelle épinière, au DRG ou à la racine dorsale, entraînant des effets indésirables inattendus chez l’animal plus tard.
3. Rétracter la première couche musculaire à l’aide de deux écarteurs, l’un placé rostralement et l’autre caudalement ; La deuxième couche de muscle, d’aspect strié, doit être visible.
4. Localisez la ligne médiane de la deuxième couche musculaire (où deux muscles longitudinaux peuvent être observés reliés par un tissu mince et membraneux). Disséquez le tissu membraneux à l’aide d’une paire de microciseaux pour séparer les deux muscles longitudinaux. Évitez d’utiliser une lame de scalpel si possible, car cela pourrait entraîner des lésions musculaires et des saignements inutiles.
5. Ajustez les écarteurs en conséquence pour exposer la troisième couche de muscle mince recouvrant la colonne vertébrale. Les apophyses épineuses peuvent être ressenties en touchant légèrement avec une paire de pinces sur la troisième couche musculaire.
6. Faites une petite incision sur la troisième couche du muscle à l’aide de microciseaux et grattez doucement le muscle de l’os à l’aide d’une curette ou d’un scalpel de manière latérale pour exposer clairement les vertèbres. Si nécessaire, coupez une partie du muscle ou du tendon pour faciliter la laminectomie.
7. Pour exposer les DRG C5 - C8 gauches, effectuez une hémi-laminectomie gauche sur les vertèbres C4 - T1 en retirant soigneusement une partie du limbe et du pédicule à l’aide d’une paire de rongeurs fins. Le DRG est situé près du foramen transversal des vertèbres.
   REMARQUE : C3 - Les vertèbres C7 n’ont pas d’apophyse épineuse proéminente. Le DRG C5 est situé entre les vertèbres C4 et C5, le DRG C6 est entre les vertèbres C5 et C6, et ainsi de suite, tandis que le DRG C8 est entre les vertèbres C7 et T1. Il n’y a pas de vertèbre C8, malgré la présence d’un DRG C8 et d’un segment C8 de la moelle épinière.
8. Une fois qu’une quantité suffisante de DRG a été exposée pour l’injection, préparez la seringue en plaçant la seringue d’un microlitre remplie de virus équipée d’une aiguille émoussée de calibre 33 sur mesure sur le porte-seringue stéréotaxique. Avant l’injection, utilisez une aiguille biseautée de calibre 30 pour faire une petite ouverture superficielle sur chacun des DRG ciblés afin de faciliter l’insertion de l’aiguille d’injection.
9. Insérez l’aiguille de calibre 33 au centre du DRG en tournant doucement les boutons pour ajuster les coordonnées stéréotaxiques. N’insérez pas trop l’aiguille, car cela pourrait provoquer une fuite de liquide par la face ventrale du DRG. En cas de fuite, ajustez immédiatement la position de l’aiguille.
   NOTE : Les coordonnées stéréotaxiques numériques ne sont pas utilisées ; Cependant, il est utile d’utiliser le cadre pour tenir l’aiguille pour l’injection.
10. Injecter 1 μL du virus dans chaque DRG à 0,2 μL/min à l’aide d’une pompe à seringue à perfusion. Attendez trois minutes supplémentaires avant de retirer l’aiguille. Pendant l’injection, le DRG changera lentement de couleur si la solution virale contient un colorant coloré.
11. Pour effectuer une blessure simultanée par écrasement de la racine dorsale C5 - C8, écrasez chaque racine trois fois pendant 10 secondes chacune à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine (Bonn Micro), en opposant complètement les extrémités de la pince ; Une ligne blanche dans le tissu doit apparaître au site d’écrasement. N’allez pas plus profondément que nécessaire avec la pince, car cela pourrait endommager la racine ventrale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	Pour visualiser une solution incolore. Concentration recommandée : 1 %
Olsen-Hegar Needle Holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup	Fine Science Tools	FST 16121-14
Bonn Micro Forceps	Fine Science Tools	FST 11083-07	Pour effectuer des blessures
Ciseaux de séparation de tissus	Fine Science Tools	FST 14072-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	FST 14058-11	<
Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Ciseaux à ressort Vannas (droits)	Fine Science Tools	FST 15018-10
SURGIFOAM Éponge résorbable en gélatine	Ethicon	1972	Pour le contrôle
Seringue microlitre RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
Aiguille amovible sur mesure (pour injection DRG)	Hamilton	7803-05	33 jauge, 38 mm, point style 3
UltraMicroPump avec contrôleur SYS-Micro4	World Precision Instruments	UMP3-1

par écrasement de la racine dorsaletd style='border-top-style :none ;hauteur :15.5pt ;largeur :208pt ;'>Micro-Adson Forceps des saignements