Évaluation de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle de rat de lésion cérébrale induite par laser

Résumé

Source : Kuts, R. et al. Lésions cérébrales induites par laser dans le cortex moteur des rats. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre l’évaluation de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) après une lésion cérébrale induite par laser chez des rats. Un colorant de pistage est injecté dans la veine de la queue, ce qui lui permet de circuler vers le cerveau et de s’infiltrer dans les tissus à travers la BHE endommagée. Le cerveau est ensuite extrait et traité pour libérer le colorant. L’intensité de fluorescence du colorant est mesurée pour quantifier l’étendue des dommages causés par la BHE induits par le laser.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Procédure

1. expérimentale de lésions cérébrales induites par laserAttribue 20 rats à un groupe marqué comme groupe laser et 20 rats à un autre groupe témoin (opéré par simulacre).
2. Soumettez le groupe laser des rats à une irradiation laser à 50J X 10 points de la manière suivante :
   1. Anesthésie le rat avec un mélange de 2 % d’isoflurane dans l’oxygène permettant une ventilation spontanée. Vérifiez la profondeur de l’anesthésique en pinçant la queue avec une pince pour voir l’absence de réflexe de retrait.
   2. Maintenir la température corporelle centrale du rat à 37 °C tout au long de la procédure expérimentale à l’aide d’un coussin chauffant régulé par la température rectale.
   3. Retirez les poils locaux avec un rasoir et désinfectez avec de l’alcool à 70 % et du gluconate de chlorhexidine à 0,5 %. Répétez l’étape de désinfection deux fois de plus.
      REMARQUE : La taille de l’incision chirurgicale doit être d’environ 3 cm. Retirez les cheveux d’au moins 2 cm autour de la zone d’incision.
   4. Placez le rat sur un support de tête stéréotaxique en position couchée et faites une incision de 3 cm pour refléter le cuir chevelu latéralement et pour exposer la zone entre Bregma et Lambda.
   5. Maintenir l’anesthésie à travers le cône nasal.
   6. Utilise un laser à grenat d’yttrium et d’aluminium (Nd-YAG) dopé au néodyme (longueur d’onde maximale 1064 nm) pour administrer 50 points J X 10, avec une durée d’impulsion de 1 s, à la zone exposée du crâne au-dessus de l’hémisphère droit.
   7. Assurez-vous que la partie génératrice laser de l’appareil se trouve à une distance de 2 mm de la zone exposée pour produire un faisceau laser. 50 points J X 10 ont été sélectionnés après une évaluation minutieuse des différentes combinaisons énergie/surface. Cette combinaison est efficace et ne provoque pas de destruction osseuse du crâne après l’administration pendant moins d’une seconde.
      REMARQUE : 2 mm est la distance entre la borne du faisceau laser (du câble optique à travers lequel il passe) et l’os du crâne. Dans le cas où une lentille de mise au point est utilisée, la distance doit être calculée en tenant compte de l’angle d’inclinaison de la lentille pour focaliser le faisceau dans la zone de dommage souhaitée. Assurez-vous d’une sécurité adéquate lors de l’utilisation d’un appareil laser, y compris une formation appropriée et une protection oculaire.
   8. Retirez le rat de l’appareil et fermez le cuir chevelu avec des sutures chirurgicales en soie 3-0.
   9. Arrêtez l’anesthésie et retournez le rat dans sa cage pour qu’il se rétablisse. Administrer localement 0,1 mL de bupivacaïne à 0,25 % pour réduire la douleur postopératoire immédiatement après la chirurgie.
      REMARQUE : L’ensemble de la procédure devrait durer moins de 5 minutes s’il est exécuté correctement.
3. Observez le rat pour tout signe de détresse pendant la récupération post-anesthésie. Avant de sortir de l’anesthésie, administrer 0,01 mg/kg de buprénorphine par voie intramusculaire pour l’analgésie postopératoire et continuer avec des doses répétées toutes les 12 h pendant au moins 48 h.
4. Soumettre les rats de contrôle aux mêmes conditions sans les soumettre au laser.

2. Score de gravité neurologique (NSS)

1. Évaluez le score de gravité neurologique 24 h après la lésion cérébrale induite par laser à l’aide d’un score de 43 points. Testez les animaux pour les déficits neurologiques, les troubles du comportement, la tâche d’équilibrage des faisceaux et les réflexes, en attribuant des scores plus élevés pour les handicaps plus graves.

3. Évaluation des lésions

1. cérébralesDétermination de l’étendue de la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BBB)
   REMARQUE : Évaluez la rupture de la BHE 24 h après la lésion cérébrale induite par laser comme suit :
   1. Administrer 2 % d’Evans Blue mélangé à 4 mL/kg de solution saline par voie intraveineuse à des rats via la veine caudale canulée et laisser la solution circuler pendant 1 h.
   2. Euthanasiez les rats en les exposant à 20 % d’oxygène et 80 % de CO₂ (via inspiration) 24 h après le dernier NSS.
   3. Récoltez le colorant localisé intravasculairement comme suit :
      1. Ouvrez les poitrines des rats avec des pincettes chirurgicales et des ciseaux chirurgicaux.
      2. Perfuser les animaux avec une solution saline refroidie à 0,9 % via le ventricule gauche en utilisant 110 mmHg jusqu’à obtenir un liquide de perfusion incolore de l’oreillette droite.
   4. Récoltez les cerveaux et coupez-les rostro-caudalement en tranches de 2 mm.
   5. Sépare les tranches de cerveau gauche des parties droites pour évaluer séparément les hémisphères blessés et non blessés.
   6. Pesez, homogénéisez à l’aide d’un mortier et d’un pilon, puis incubez les tissus cérébraux dans de l’acide trichloracétique à 50 % pendant 24 h.
   7. Centrifuge les tranches de cerveau homogénéisées à 10 000 × g pendant 20 min.
   8. Mélangez 1 mL du surnageant du cerveau centrifugé avec 1,5 mL d’éthanol à 96 % à 1:3 et évaluez la rupture de la barrière hémato-encéphalique à l’aide d’un détecteur de fluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 620 nm (bande passante de 10 nm) et à une longueur d’onde d’émission de 680 nm (bande passante de 10 nm).
      REMARQUE : Les deux groupes de rats subissent le même protocole pour déterminer la répartition de la BBB.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 % d’acide trichloracétique	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Matrices cérébrales et tissulaires	SIGMA - ALDRICH	15013
Canule Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Centrifugeuse Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Balances analytiques compactes	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Balance numérique	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Ciseaux de dissection	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Pipette Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884 <
SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Éthanol 96 %	ROMICAL		Liquide
Evans Blue 2 %	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Détecteur de fluorescence	Tecan, Männedorf Suisse	modèle Infinite 200 PRO lecteur multimode
Chauffage avec thermomètre	Coussin chauffant-1	Modèle : HEATINGPAD-1/2
Brassard de perfusion	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100 %	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Microscope Olympus BX 40 Olympus
Boîtes de Pétri	SIGMA - ALDRICH	P5606
Lames de scalpel 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd :YAG (grenat d’aluminium yttrium dopé au néodyme)	machine laser Laser Industries Ltd
Support de tête stéréotaxique	KOPF	900LS
Seringue stérile 2 ml	Braun	4606027V
Aiguille de seringue 27 G	Braun	305620

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