Localisation par fluorescence des protéines de jonction serrée et des fibres de stress dans les cellules endothéliales

Résumé

Source : Alluri, H., et al. Privation et réoxygénation d’oxygène-glucose en tant que modèle de lésion d’ischémie-reperfusion in vitro pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique. J. Vis. Exp. (2015).

La vidéo démontre la localisation fluorescente des protéines de jonction serrée et des fibres de stress dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau du rat (RBMEC). Dans la monocouche stressée, des anticorps marqués par fluorescence sont utilisés pour marquer les protéines de jonction serrée, tandis que la phalloïdine marquée au fluorophore marque les fibres de stress. Les molécules marquées sont ensuite visualisées par microscopie confocale.

Protocole

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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :12pt ;' dir='ltr'>1. Ensemencement des cellules endothéliales

1. Obtenir des cultures primaires de RBMECs à partir de rats Sprague Dawley adultes (ou les obtenir commercialement).
2. Cultivez des RBMEC dans des boîtes de Pétri enrobées de fibronectine (50 μg/ml) de 100 cm à l’aide du milieu de croissance des cellules endothéliales du cerveau de rat. Changez de milieu tous les deux jours, jusqu’à ce que la confluence soit atteinte.
3. Lorsque vous atteignez 80-90 % de confluence, lavez doucement les cellules dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en les remuant. Les cellules sont ensuite détachées en les exposant à 1 ml d’une solution chaude d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 %, équilibrée à 37 °C.
4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce qu’elles se détachent et se dispersent.
   NOTE : Tapotez la boîte de culture pour détacher les cellules. Examinez les cellules au microscope pour confirmer le détachement complet des cellules de la surface de la boîte.
5. Ajouter 5 ml de milieu complet dans la boîte de Pétri pour neutraliser la trypsine. Pipetez le milieu contenant les cellules détachées et collectez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml.
6. Centrifuger le milieu contenant des cellules endothéliales à 220 x g pendant 5 min.
7. Aspirez le surnageant et conservez les cellules contenant la pastille. Suspendez la pastille dans 3 à 5 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales de cerveau de rat frais en le mélangeant doucement de haut en bas avec une pipette. Les cellules seront ensuite comptées à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre.
8. Transférez la suspension cellulaire dans un système de lames à chambre stérile à 8 puits pré-enduit de fibronectine (50 μg/ml), 0,7 cm<span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>²/puits avec une densité d’ensemencement variant entre 10 000 et 15 000 cellules par puits. Augmentez les cellules à 37 °C jusqu’à ce que la confluence soit atteinte
   NOTE : Pour effectuer des transferts Western ou d’autres expériences, les cellules peuvent être cultivées dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm ou des boîtes spéciales selon les besoins de l’expérience.

2. Privation d’oxygène et de glucose-réoxygénation (OGD-R) In Vitro Model

1. Utilisez le système de culture cellulaire d’hypoxie pour étudier les effets de l’OGD-R sur les RBMECs dans (voir Figure 1). Installez et calibrez le système de culture cellulaire d’hypoxie avant de commencer l’expérience, conformément aux instructions du fabricant.
2. Retirez les lames de la chambre confluente (étape 1.8) de l’incubateur à 37 °C. Remplacez le milieu complet dans la lame de chambre par du médium modifié de Dulbecco (DMEM) désoxygéné, sans glucose, et placé dans la chambre d’hypoxie avec 95 %, N₂ et 5 % CO₂ pendant 2 h à 37 °C, pour représenter la condition de l’OGD.
3. Ramenez les cellules dans l’incubateur avec 95 % O₂, 5 % CO₂ à 37 °C et alimentés avec du milieu complet de cellules endothéliales de cerveau de rat frais et incuber pendant 1 heure supplémentaire à 37 °C.
   NOTE : Cette étape représente une situation de réoxygénation.
4. Utilisez les lames de la chambre pour la localisation par immunofluorescence et le marquage à la rhodamine phalloïdine (voir rubrique 3).

3. Immunofluorescence Localisation de la zonula occludens-1 (ZO-1) et de l’actine filamenteuse (f-actin) Étiquetage à l’aide de rhodamine phalloïdine

1. Exposez les lames de chambre contenant des monocouches RBMEC à 100 μl d’opti-MEM/milieu sérique réduit/puits pendant 1 h. Lavez les lames de chambre 3 fois dans 100 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,0-7,2).
2. Fixez les cellules à l’aide de 100 μl de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (pH 7,0-7,2) pendant 15 minutes et lavez les lames de la chambre 3 fois de plus dans du PBS (pH 7,0-7,2).
3. Perméabiliser les cellules à l’aide de 100 μl de Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS (pH 7,0-7,2) pendant 15 minutes supplémentaires. Bloc avec 100 μl d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % dans du PBS pendant une heure. Après cette étape, colorez/étiquetez les cellules pour ZO-1 ou f-<span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>actin.
   1. Pour la coloration par immunofluorescence, incubez les cellules avec un anticorps primaire anti-lapin contre ZO-1 au 1:150, préparé dans du BSA-PBS à 2 % pour une nuit (O/N) à 4 °C. Lavez les cellules 3 fois dans du PBS (pH 7,0-7,2). Incuber avec 100 μl d’anticorps secondaire anti-lapin marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pendant 1 heure à température ambiante (RT).
   2. Pour le marquage à la rhodamine phalloïdine, après le blocage, exposer les cellules à 100 μl de rhodamine phalloïdine en dilution 1:50, préparée dans 2 % de BSA-PBS, pendant 20 min.
   3. Laver les cellules de la coloration par immunofluorescence et du marquage à la rhodamine phalloidine dans le PBS (pH 7,0-7,2). Montez les chambres à l’aide d’un milieu de montage contenant un réactif anti-décoloration avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
4. Visualisez les cellules à l’aide d’une lentille d’immersion dans l’eau 60 X et les cellules sont balayées dans un seul plan optique sous un microscope confocal.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Proox model 110
DMEM, no glucose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 puits stérile, lames de verre	Thermo scientific	177402
FITC-tagged anti-rabbit secondaire anticorps	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Tout autre PBS disponible peut être utilisé