Un modèle minimal de lésion de la moelle épinière pour étudier l’activation et la migration des cellules souches neurales

Résumé

Source : Lakshman, N., et al. Un test de la neurosphère pour évaluer l’activation des cellules souches neurales endogènes dans un modèle murin de lésion minime de la moelle épinière. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo démontre l’activation et la migration des cellules souches neurales (NSC) dans un modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris. Pour exposer la moelle épinière, une vertèbre de la région thoracique de la colonne vertébrale est retirée d’une souris anesthésiée. Une lésion superficielle est alors créée dans la substance blanche de la moelle épinière à l’aide d’une aiguille pliée, qui préserve le canal central. Après la blessure, les NSC entourant le canal sont activés et migrent vers le site de la blessure pour aider à la réparation des tissus.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Chirurgie minime des lésions de la moelle épinière

REMARQUE : Avant l’opération, assurez-vous que tous les instruments et matériaux chirurgicaux sont stérilisés par des méthodes appropriées (Figure 1A).

1. Construisez un arc de soutien thoracique en enroulant 4 à 5 carrés de gaze et en les collant ensemble au milieu pour obtenir un rouleau fixe de gaze.
2. Placez la souris dans la chambre d’induction et commencez l’anesthésie avec 5 % d’isoflurane. Confirmez l’absence de réflexe de pincement des orteils avant de procéder, ainsi que tout au long de la procédure. Comme l’intervention chirurgicale peut durer plus de 30 minutes, optimisez l’exposition minimale à l’isoflurane (5 minutes à 5 % et le reste du temps à 2 à 3 %).
3. Transférez la souris dans un cône nasal fixé à l’appareil d’anesthésie à une dose d’entretien de 2 à 3 % d’isoflurane. Utilisez une tondeuse à cheveux pour enlever la fourrure du dos de l’animal, du milieu du dos jusqu’au cou ou aux oreilles, afin d’exposer une large zone rectangulaire de peau pour la chirurgie.
4. Transférez la souris dans un instrument stéréotaxique en plaçant son nez dans le cône nasal attaché et en stabilisant le crâne avec des barres d’oreille. Maintenez l’isoflurane à 5 % pendant le placement des barres d’oreille et le bas du dos à 2 à 3 % une fois que la souris est fixée dans le dispositif stéréotaxique.
5. Administrer des analgésiques préopératoires par voie intrapéritonéale – méloxicam (2,0 mg/kg). Appliquez généreusement une lubrification oculaire sur les yeux de souris ouverts pour prévenir la dessiccation de la cornée sous anesthésie.
6. Placez l’arc de soutien thoracique sous l’abdomen de la souris tout en redressant le corps et la colonne vertébrale de la souris en tirant légèrement sur la base de la queue. Utilisez du ruban adhésif de laboratoire pour fixer la queue et tous les membres étendus dans une position en étoile. Une fois en sécurité, poussez l’arc de soutien thoracique vers le haut du thorax, de l’abdomen de la souris vers le haut du thorax - afin de soutenir la colonne thoracique (Figure 1B).
7. Préparez un champ opératoire stérile en désinfectant la zone de peau coupée de fourrure préparée à l’étape 1.3 avec de l’éthanol à 70 %, suivi de povidone iodée. Répétez l’opération deux fois. Appliquez un champ chirurgical stérile pour garder un large champ stérile.
8. À l’aide d’une lame de scalpel #10, faites une incision verticale parallèle à l’axe longitudinal de l’animal à partir du point médian des deux omoplates jusqu’à la courbure de la colonne thoracique. Rétracter la peau pour exposer les tissus mous et le contour de la colonne vertébrale (Figure 1C).
9. Identifiez le bord inférieur du coussinet adipeux suprascapulaire (cela délimite le niveau vertébral T4/5). Avec la même lame #10, avec précaution mais force, coupez le long des deux côtés de l’os vertébral T5-T8/9 pour détacher les tendons des muscles dorsaux de la colonne.
10. Insérez les dents des écarteurs dans les sites d’incision de chaque côté de la colonne vertébrale. Ajustez l’exposition en élargissant les écarteurs pour élever suffisamment la colonne vertébrale sans trop solliciter les couches musculaires rétractées (Figure 1D).
11. Au microscope chirurgical, nettoyez soigneusement le muscle résiduel et les autres tissus mous recouvrant la colonne vertébrale pour exposer l’os vertébral (Figure 1E). Identifiez les vertèbres qui seront enlevées en serrant l’apophyse épineuse des vertèbres avec une pince dentée et en la déplaçant légèrement de haut en bas.
    REMARQUE : Cela devrait permettre l’identification des articulations intervertébrales et exposer les petites ouvertures (foramens intervertébraux) sous les vertèbres d’intérêt.
12. Insérez une tête des ciseaux incurvés émoussés de chaque côté du foramen intervertébral exposé, caudale à la lame vertébrale à exciser, et coupez les articulations intervertébrales de liaison bilatéralement.
13. Soulevez le limbe vers le haut et coupez l’attache supérieure du limbe pour isoler et retirer l’os.
    REMARQUE : Cela exposera le sac dural intact contenant la moelle épinière (Figure 1F). Il peut y avoir des saignements excessifs qui peuvent être contrôlés en plaçant une gaze prédécoupée de 1 cm x 1 cm sur les zones touchées et/ou en lavant avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
14. Avec la veine médiane dorsale servant de point de repère, insérez une tige courbée à 45° d’une pointe d’aiguille de 30 G (avec le biseau de l’aiguille vers le haut) dans la surface dorsolatérale de la moelle épinière (environ 1 mm de profondeur) à environ 0,5 mm latéralement de chaque côté de la ligne médiane.
15. Déplacez l’aiguille de ~2 mm de la caudale à la rostrale (parallèlement à la ligne médiane) de sorte que toute la longueur du biseau de l’aiguille soit insérée dans le cordon. Retirez l’aiguille en revenant sur vos traces par le chemin d’entrée (Figure 1G).
    REMARQUE : Il ne devrait pas y avoir de saignement mais un gonflement du tissu rachidien peut être observé à cette étape.
16. Pour fermer la plaie, retirez l’écarteur et suturez les muscles du dos de chaque côté de la blessure ensemble sur la ligne médiane à l’aide d’une suture résorbable 6-0. Utilisez une suture en soie stérile 4-0 pour fermer ensuite la peau sus-jacente.

Résultats

Figure 1 : Intervention chirurgicale. (A) La disposition de tout ce qui est requis, numérotée pour référence. (B) Une image de la souris dans un appareil stéréotaxique avec un corps redressé, une colonne vertébrale et des membres étalés et scotchés avec un arc de soutien thoracique placé en dessous. (C) Une photo de la souris avec une incision cutanée...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Ciseaux à ressort Vannas-Wolff (courbé)	Fine Science Tools	15370-50	Personnalisez lors de la commande pour obtenir des pointes émoussées
Pince Graefe (droite, 1x2 dents)	Fine Science Tools	11053-10
Pince Graefe extra fine (courbée, dentelée)	Fine Science Tools	11152-10	Or toute autre pince pour suturer
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	Ou tout autre outil approprié pour la suture
Manche de scalpel #3	Fine Science Tools	10003-12	Ou tout autre
Tondeuses à cheveux	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	ou tout autre approprié
Instrument stéréotaxique	Stoeling	51500	ou tout autre approprié
Meloxicam			ou tout autre établissement de soins pour animaux approprié sanctionné par l’établissement de soins aux animaux
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	ou tout autre
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	ou tout autre approprié pour l’anesthésie
Q-tips Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Gaze de coton	Fisher Scientific	13-761-52
30G Aiguilles	Becton Dickinson	305106	Pour les blessures
25G Aiguilles	Becton Dickinson	305122	Pour les injections
1mL Seringues	Becton Dickinson	3090659	pour les injections
3mL Seringues	Becton Dickinson	309657	pour les injections de fluide<
uoftmedstore.com	2297-VS881	pour la
6-0 Suture	uoftmedstore.com	VS889	pour la
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection Microscope	Zeiss	Stemi 2000

approprié. approprié de médicaments de médicamentstd style='hauteur :14.5pt ;largeur :237pt ;'>4-0 Suture suture cutanée suture musculaire