Réalisation d’une immunohistochimie sur le tissu cérébral d’un primate non humain

Résumé

Source : Eid, L. & Parent, M. Préparation de tissu cérébral de primates non humains pour l’immunohistochimie et la microscopie électronique avant intégration. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre la préparation de tissu cérébral de primate non humain fixé à l’aldéhyde à l’aide de l’immunohistochimie de pré-intégration pour la microscopie électronique. Il décrit les étapes de l’immunomarquage d’une protéine neuronale spécifique, suivie d’une réaction de peroxydase qui produit un précipité coloré, permettant de visualiser la protéine cible en microscopie électronique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Immunohistochimie de pré-intégration (Figure 1C)

1. Préparez une solution mère de 4 L de solution saline tamponnée au tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) comme suit.
   1. Mesurer 2 L d’eau distillée dans un bécher de 4 L, ajouter 24,23 g de trihydroxyméthyl aminométhane (THAM ; C₄H₁₁NO₃), et remuez pour dissoudre.
   2. Ajustez le pH à 7,6 avec environ 148 mL de HCl 1 N. L’acide doit être ajouté avec prudence pour éviter d’atteindre un pH inférieur à 7,6. Le volume total doit être de 4 L.
      ATTENTION : HCl est très corrosif. Portez l’EPI approprié.
2. Sélectionnez des sections contenant la région d’intérêt à traiter pour l’immunohistochimie EM.
3. Lavez les sections flottantes 3 fois dans du PBS (0,1 M, pH 7,4) pendant 5 min à RT pour rincer la solution d’antigel.
4. Préparez une solution à 0,5 % de NaBH₄ diluée dans du PBS.
   1. Peser 0,05 g de NaBH₄ et le diluer dans 10 mL de PBS. Ne pas couvrir. Préparez cette solution juste avant de l’utiliser.
5. Incuber les sections dans la solution fraîchement préparée de NaBH₄ pendant 30 min à RT. Rock doucement. Ne pas couvrir.
6. Laver 3 fois dans du PBS pendant 10 minutes à RT, en secouant vigoureusement jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gaz de réaction.
7. Préparez une solution bloquante pour l’EM avec 2 % de sérum normal approprié et 0,5 % de gélatine de poisson froide diluée dans du PBS.
   REMARQUE : La quantité doit être calculée afin d’en avoir assez pour les trois étapes suivantes. Évitez d’utiliser des méthodes de récupération d’antigènes ou l’ajout de petites quantités de triton (pour augmenter la pénétration des anticorps), car ces méthodes compromettent considérablement la qualité des tissus.
8. Incuber les sections dans la solution de blocage pendant 1 h à RT. Basculez doucement.
9. Préparez une solution d’anticorps primaires diluée dans la solution bloquante.
   REMARQUE : La concentration de l’anticorps primaire est généralement la même que celle de l’immunohistochimie LM, mais envisagez d’effectuer des tests avec différentes concentrations d’anticorps au préalable, car certains anticorps primaires peuvent ne pas fonctionner avec l’acroléine. Si c’est le cas, il est possible d’utiliser un mélange de glutaraldéhyde (0,1 à 2 %) et de 4 % de PFA pour la perfusion transcardiaque et d’obtenir des résultats similaires. Optimisez également le temps d’incubation et la température.
10. Incuber les sections dans une solution d’anticorps primaires pendant la nuit à l’heure de l’artérologie avec un léger balancement. Utilisez une durée et une température d’incubation préalablement testées.
11. Lavez les sections 3 fois dans du PBS pendant 5 minutes à RT avec un balancement doux.
12. Préparez une solution 1:1 000 d’anticorps secondaires biotinylés dilués dans la solution bloquante.
    REMARQUE : L’anticorps secondaire doit être élevé contre l’espèce hôte utilisée pour générer l’anticorps primaire.
13. Incuber les sections dans une solution d’anticorps secondaire pendant 1,5 h à RT. Secouez doucement.
14. Préparez une solution d’avidine-biotine-peroxydase (ABC) au moins 60 minutes avant la fin de l’incubation secondaire de l’anticorps.
    1. À l’aide d’une pipette calibrée, mesurer 8,80 μL/mL des solutions A et B et les diluer dans du PBS.
    2. Balancez doucement pendant au moins 60 minutes à RT pour permettre la liaison complète entre les molécules d’avidine et de biotine.
15. Après l’incubation dans la solution secondaire d’anticorps, laver 3 fois dans du PBS pendant 10 min à RT.
16. Incuber les sections dans la solution ABC pendant 1 h à RT. Secouer doucement.
17. Laver une fois en PBS et deux fois en TBS pendant 10 min à RT avec un balancement doux.
18. Préparez une solution fraîche de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) à 0,05 % avec 0,005 % de H₂O₂ diluée dans du TBS.
    1. Pesez 12,5 mg de DAB et diluez-le dans 25 ml de TBS froid. Protégez-le de la lumière.
       ATTENTION : La poudre DAB est très volatile et nocive si elle est inhalée. Il est cancérigène et tératogène. Ainsi, les femmes enceintes ou allaitantes ne doivent pas manipuler ce produit, même dilué. Utilisez un masque N95 lors de la manipulation et portez un EPI.
    2. Filtrez la solution et ajoutez 4,5 μL de H₂O₂ juste avant l’utilisation.
19. Incuber des sections dans la solution DAB pendant 3 à 7 min à RT. Basculez doucement.
    REMARQUE : Le précipité brun ne doit pas être trop foncé afin d’éviter un niveau élevé de taches de fond. Le temps d’incubation doit être optimisé en conséquence.
20. Arrêtez la réaction en lavant rapidement deux fois en TBS froid, puis deux fois pendant 10 min en TBS froid en RT, puis deux fois pendant 10 min en PB, avec un léger balancement.
    NOTE : L’utilisation de PB (et non de PBS) est critique afin d’éliminer toute trace de NaCl, car il réagirait avec l’osmium et formerait des cristaux.

Résultats

Figure 1 : Schémas des étapes essentielles du protocole. La cervelle de singe (A) est découpée en sections sérielles avec un vibratome de refroidissement (B). Il...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
phosphate de sodium anhydre dibasique	Fisher scientific	S374-500	<
Monobasic monohydrate sodium phosphate	EM Science	SX0710-1
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Le produit est corrosif. Utiliser avec une potection appropriée.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Le produit est corrosif. Utiliser avec une protection appropriée.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4 % de dilution. Le produit est très volatil sous forme de poudre et très toxique. Utiliser avec prudence sous une cagoule de ventilation avec une protection appropriée.
Acroléine (90 %)	sigma	110221	3 % de dilution. Le produit est hautement toxique. À utiliser sous une cagoule de ventilation avec une protection appropriée.
Autopsy venting table	Mopec	CE400	<
Pompe de perfusion électronique	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine		<
Xylazine	<	4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Lance de plume	201011 J9913	No.22 pour la chirurgie et No. 11 pour EM
Ciseaux chirurgicaux
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrez la lame avant chaque utilisation, lorsque l’appareil le permet
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	dilution de 30 %
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30 % dilution
Sodium borohydride	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2 % dilution
Cold-fish gélatine	Aurion	900.033	0,5 % de dilution. Le produit original est concentré à 40 %
Anticorps primaire, SERT	biotechnologie de Santa Cruz	SC-1458	1/500 dilution
Anticorps primaire, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Anticorps primaire, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
anticorps secondaire biotinylé, chèvre	Vector laboratories	BA-9500	dilution 1/1000
Anticorps secondaire biotinylé, souris	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 μL/mL de A et B chacun
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05 % dilution. Le produit est très volatil sous forme de poudre et toxique. Ne jetez pas de déchets dans l’évier.
Peroxide 30 %	Fisher scientific	H-323	0,005 % dilution

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