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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
- Coloration des tissus
- Dans une boîte de coloration étanche à la lumière, créez une « chambre d’humidité » avec des tissus non pelucheux imbibés d’eau déminéralisée.
- Séchez les bords de la diapositive avec un mouchoir non pelucheux, utilisez un mini stylo Pap pour faire une bordure hydrofuge sur le bord même de la diapositive, loin des sections de tissu. Cette bordure doit assurer un espace suffisant entre le ménisque du liquide et le bord du tissu afin que la tension superficielle n’affecte pas la coloration.
REMARQUE : La bordure répulsive du stylo pap peut être appliquée avant la version 1.1.3 si les anticorps d’intérêt ne nécessitent pas de récupération d’antigène micro-ondes. Si le stylo Pap a été appliqué avant le lavage dans le PBS, l’intégrité de la bordure hydrofuge doit être vérifiée à cette étape. Utilisez un mini-stylo Pap pour combler les trous dans la bordure. - Avec des lames posées horizontalement, bloquez la liaison de l’antigène non spécifique en l’incubant dans du sérum à 4 % v/v dans du PBS (solution en bloc). Pipette 300 μl de solution en bloc par lame pendant 1 heure à température ambiante. Assurez-vous que la solution en bloc s’étend jusqu’au stylo Pap sur le bord de la lame et recouvre complètement le tissu pour éviter les taches inégales causées par la tension superficielle près du tissu.
- Utilise du sérum de la même espèce chez lequel l’anticorps secondaire est fabriqué. Remarque : Dans cette procédure, les anticorps secondaires sont fabriqués chez l’âne, et donc le sérum d’âne est utilisé. Si des anticorps secondaires de deux espèces différentes ou plus sont utilisés, incluez le sérum de chaque espèce.
- Pipette l’anticorps primaire sur les lames. Remarque : Les concentrations d’anticorps pour cette coloration ont été optimisées à 1:5 000 et 1:500 pour Iba1 et Pan-neuronal, respectivement. On a constaté que ces concentrations présentaient une coloration significative sans coloration de fond.
- Diluez la solution en bloc à 1 % de sérum dans du PBS et ajoutez des anticorps primaires. Pipeter 300 μl de solution d’anticorps primaires dans 1 % de sérum par lame. Encore une fois, assurez-vous que le liquide se trouve jusqu’au bord du stylo Pap. Incuber toute la nuit à 4 °C.
- Incluez trois diapositives de contrôle : une qui ne contient ni Iba1 ni anticorps pan-neuronaux, une avec Iba1 sans anticorps pan-neuronal, et une avec un anticorps pan-neuronal sans Iba1. Colorez ces lames dans le même cycle avec les mêmes solutions, mais omettez les anticorps primaires pour tester la liaison non spécifique des anticorps secondaires.
- Le lendemain matin, lavez les lames trois fois dans PBS pendant 5 min chacune, en changeant la solution entre les lavages.
- Les anticorps fluorescents sont sensibles à la lumière, donc, à partir de cette étape, minimisez l’exposition à la lumière en vous assurant que les récipients de lavage sont enveloppés dans du papier d’aluminium et que les boîtes d’hybridation sont soit noires, soit incubées dans l’obscurité. Pipeter les anticorps secondaires appropriés sur toutes les lames et incuber pendant 60 min à température ambiante à une concentration de 1:250 dans une solution en bloc (voir étape 1.2.3) dans une « chambre humide » étanche à la lumière (voir étape 1.2.1).
- Utilisez des anticorps secondaires de différentes longueurs d’onde. Ici, pour l’anticorps primaire anti-Iba1 chez le lapin, utilisez l’âne anti-lapin 594 comme anticorps secondaire approprié. Pour l’anticorps primaire anti-Pan-neuronal de souris, utilisez l’anti-souris d’âne 488 comme anticorps secondaire approprié. Vous pouvez également utiliser l’anti-lapin 488 et l’anti-souris 594.
- Lavez les diapositives trois fois dans PBS pendant 5 min chacune.
- Facultatif : effectuer la coloration nucléaire.
- Place in Hoechst (ou autre coloration nucléaire) à une concentration de 0,03 μg/ml en H style='background-color :transparent ;color :#000000 ;'>2O pendant exactement 60 sec.
- Lavez les diapositives trois fois dans PBS pendant 5 min chacune.
- Wash in ddH2O.
- Coverslipping
- Lames avec un support de montage aqueux, tel que Fluoromount-G ou ProlongGold. Prenez soin d’éliminer toutes les bulles à l’aide d’un applicateur à embout de coton.
Remarque : D’autres agents de montage pourraient être utilisés, mais un fort saignement entre les colorants a été noté par certains dans les jours qui ont suivi la pose d’un coverslip. - Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller les bords, empêchant ainsi les sections de se dessécher à cause de l’évaporation. Laissez sécher le vernis à ongles dans un récipient étanche à la lumière tandis que les lames restent plates et à température ambiante, puis conservez-les dans un récipient étanche à la lumière enveloppé dans une feuille d’aluminium à 4 °C.