Coloration immunohistochimique de biomarqueurs dans des coupes de la neurosphère d’une tumeur cérébrale

Résumé

Source : Núñez, F. J., et al. Évaluation des biomarqueurs dans le gliome par immunohistochimie sur des cultures de gliome 3D de la neurosphère intégrées à la paraffine. J. Vis. exp. (2019).

Cette vidéo fait la démonstration d’une technique immunohistochimique pour le marquage de biomarqueurs tumoraux dans les neurosphères tumorales cérébrales intégrées à la paraffine. Les sections de la neurosphère subissent une élimination de la paraffine et une réhydratation, suivies d’un traitement visant à exposer les sites de biomarqueurs. Des anticorps primaires et secondaires sont ensuite appliqués pour marquer ces biomarqueurs. Les anticorps secondaires sont liés par des enzymes peroxydases conjuguées à l’avidine, qui oxydent les substrats chromogènes pour indiquer l’emplacement des biomarqueurs. Enfin, la contrecoloration nucléaire et la préparation des lames sont effectuées pour l’analyse microscopique.

Protocole

1. Immunohistochimie (IHC) des neurosphères enrobées de paraffine (NS)

1. Faites fondre la paraffine en plaçant les lames dans une grille métallique et en les incubant à 60 °C pendant 20 min.
2. Déparaffiniser les lames par incubation dans un train de réhydratation à température ambiante (RT) : 3x xylène pendant 5 min, 100 % 2x éthanol pendant 2 min, 95 % 2x éthanol pendant 2 min, 70 % 1x éthanol pendant 2 min et 1x eau déminéralisée pendant 2 min. Ensuite, conservez les lames dans l’eau du robinet jusqu’à la récupération de l’antigène, car le dessèchement provoquera une liaison d’anticorps non spécifiques.
3. Incuber les lames dans un tampon de citrate (10 mM d’acide citrique, 0,05 % de détergent non ionique, pH 6) à 125 °C pendant 30 s et à 90 °C pendant 10 s. Laissez-les refroidir, puis rincez les lames 5 fois à l’eau distillée.
4. Incuber les lames à RT dans 0,3 % H₂O₂ pendant 30 min.
5. Laver les lames 3 fois dans un tampon de lavage (0,025 % de détergent dans une solution saline tamponnée au Tris [TBS]) pendant 5 min en agitant doucement.
6. Incuber les lames à RT avec une solution bloquante (10 % de sérum de cheval, 0,1 % d’albumine sérique bovine [BSA] dans le TBS) pendant 30 min.
7. Incuber les lames pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée avec un anticorps primaire préparé dans une solution de dilution (0,1 % BSA dans le TBS). Lavez les lames 3 fois dans un tampon de lavage pendant 5 minutes en agitant doucement.
8. Incuber les lames à RT pendant 1 h avec un anticorps secondaire biotinylé préparé dans une solution de dilution. Lavez les lames 3 fois dans un tampon de lavage pendant 5 minutes en agitant doucement.
9. Incuber les lames à RT dans l’obscurité pendant 30 min avec le complexe de peroxydase de raifort avidine-biotinylé. Lavez les lames 3 fois dans un tampon de lavage pendant 5 minutes en agitant doucement.
10. Incuber les lames avec de la 3,3′-diaminobenzidine (DAB)-H₂O₂ marques de substrat ici pendant 2 à 5 min à RT.
11. Rincez 3 fois à l’eau du robinet. Trempez (1-2 s) les lames dans une solution d’hématoxyline pour les contre-tacher, puis rincez-les abondamment à l’eau du robinet jusqu’à ce qu’elles soient claires.
12. Déshydratez les lames comme suit : incubez dans de l’eau distillée pendant 2 min, trempez-les 3 fois dans de l’éthanol à 80 %, incubez dans de l’éthanol à 95 % 2 fois pendant 2 min chacune, incubez dans de l’éthanol à 100 % 2 fois pendant 2 min chacune, et enfin dans du xylène 3 fois pendant 3 min chacune.
13. Placez les lames à l’aide d’un support de montage à base de xylène et laissez-les sécher sur une surface plane à RT jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie.

REMARQUE : Si vous effectuez une coloration DAB, les lames peuvent être stockées à RT. Cependant, si une coloration par immunofluorescence est effectuée, les lames doivent être stockées dans l’obscurité à -20 °C pour réduire le photo-blanchiment.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rabbit polyclonal anti-ATRX,Santa	Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, dilution 1:1000
Lapin polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, dilution 1:500	Chèvre polyclonal anti-lapin biotine conjugué Dako E0432 IHC, dilution 1:1000	Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
Biocare medical	BDB2004 L/prix jusqu’au 12/18

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