Analyse ultrastructurale d’une section de cerveau de souris à l’aide de la microscopie électronique à transmission

Abstract

Source : Lutz, D., et.al. Évaluation des paramètres de neuroplasticité ultrastructurale après transduction in utero du cerveau et de la moelle épinière de souris en développement. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo montre la préparation et l’analyse en microscopie électronique à transmission (MET) d’une section du cerveau d’un bébé souris. Le protocole commence par un tissu fixé au tétroxyde d’osmium intégré dans de la résine, suivi d’un découpage précis pour isoler la région d’intérêt et d’une ultramicrotomie pour produire des coupes semi-minces et ultraminces, qui sont visualisées à l’aide de la microscopie optique et de la TEM, respectivement.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Sélection des paramètres de neuroplasticité ultrastructurale pour l’analyse quantitative

1. Cartographie de la zone d’intérêt
   1. Choisissez une zone d’intérêt (par exemple, l’hippocampe ou le cervelet) et localisez la zone dans l’atlas de section en choisissant l’image de l’atlas qui contient cette zone.
   2. Tracez les limites de la zone d’intérêt sur l’image de la coupe et trouvez/superposez ces limites de région sur l’échantillon de résine.
   3. Marquez à gratter les limites de la zone d’intérêt (p. ex., hippocampe ou cervelet) sur l’échantillon de résine, à l’aide d’une aiguille fine (26 G, 1 po).
   4. Chauffez l’échantillon de résine à 85 °C dans un four pour ramollir la résine pour la coupe ou, alternativement, utilisez un appareil de coupe, une lame fine ou du papier de verre.
   5. Excisez la zone d’intérêt de l’échantillon de résine à l’aide d’une lame de rasoir. Montez l’échantillon sur des barres de support en verre acrylique du calibre requis (par exemple, d’un diamètre de 8 mm et d’une longueur de 1 cm) avec de la colle. Coupez l’éprouvette montée pour les coupes semi-minces et ultra-minces.
   6. Préparez des sections semi-fines (0,75 μm) et ultrafines (70 nm) de la zone coupée à l’aide d’un ultramicrotome : réglez-le à 1,5 mm/s pour une épaisseur de 0,75 μm et à 0,7 mm/s pour une épaisseur de 70 nm.
   7. Recueillir les sections semi-minces sur des supports en verre et colorer les sections avec 1 % de bleu de toluidine dans du PBS (pendant 4 min).
   8. Lavez les sections plusieurs fois dans de l’eau déminéralisée. Examinez les coupes colorées au microscope optique à l’aide d’objectifs 4x (NA de 0,1 ∞/-), 10x (NA de 0,22 ∞/0,17), 40x (NA de 0,65 ∞/0,17) et 100x (NA de 1,25 ∞/0,17).
   9. Collectez des sections ultraminces sur des grilles en nickel. Soumettre les grilles à la MET à 180 kV et à un grossissement de 3 200x, 6 000x et/ou 8 000x.
2. Analyse TEM
   1. Choisissez les paramètres ultrastructuraux d’intérêt pour l’analyse TEM quantitative (par exemple, boutons avec vésicules et mitochondries ou axones myélinisés et non myélinisés) et prenez des images TEM de ces paramètres sous un grossissement de 3 500x, 6 000x et/ou 8 000x.

Materials